ANÁLISIS BIOINFORMATICO Y PREDICCIÓN DE GENES EN SECUENCIAS GENOMICAS DE Clostridium sp. IBUN22A
Análisis bioinformático y predicción de genes en secuencias genómicas de Clostridium sp. IBUN22A
Bioinformatic analysis and gene prediction in genomic sequences from Clostridium sp. IBUN22A
José David Montoya Solano*, Zulma Rocío Suárez Moreno**, Dolly Montoya Castaño ***, Fabio Ancízar Aristizábal Gutiérrez ****
RESUMEN
Este trabajo tuvo como propósito identificar secuencias de genes en clones obtenidos en una librería genómica de la cepa colombiana de Clostridium sp. IBUN 22A. Los insertos de nueve clones con tamaæos superiores a 500 pb fueron secuenciados y analizados por medio de bœsquedas de los insertos completos o de sus marcos abiertos de lectura (ORFs) traducidos en GenBank 141.0 y Uniprot 6.6 con BLAST 2.2.8. Se identificaron seis genes con alta similaridad a genes de metabolismo bÆsico (housekeeping) en diferentes especies de Clostridium. En el clon pBsIBUN22A-1 se localizó una secuencia de 851 pb con una identidad del 99.74% respecto al gen codificante de la enzima glicerol deshidratasa (DhaBl) de Clostridium butyricum (AY968605) involucrada en la producción de 1,3 Propanodiol (1,3-PD). La identifica­ción de genes presentes en la cepa nativa Clostridium IBUN 22A abre la puerta a la investigación básica y a la ingeniería metabólica para hacer más rentable el proceso de producción de 1,3-PD junto al conocimiento de los genes presentes en la cepa nativa.
Palabras clave: análisis de secuencias, librería genómica, Clostridium, glicerol deshidratasa, 1,3-propanodiol.
ABSTRACT
This work was aimed at identifying gene sequences in recombinant clones obtained from a genomic library from the Colombian Clostridium sp. IBUN 22A native strain. Nine clones greater than 500 bp were sequenced and analysed using BLAST 2.2.8 to search for complete inserts or their translated open reading frames (ORFs) in GenBank 141.0 and Uniprot 6.6. Seven genes having high similarity to housekeeping genes from different Clostridium species were identified. An 851 bp sequence was located in the pBsIBUN22A-1 clone, having 99.74% identity with the gene encoding the Clostridium butyricum enzyme glycerol dehydratase (DhaBl) which is involved in 1,3-propanediol (1,3-PD) production. Identifying genes in the native IBUN 22A strain formed the starting point for basic research and metabolic engineering aimed at making 1,3-PD production more profitable and increasing knowledge of genes present in the native strain.
Key words: glycerol dehydratase, 1,3-propanediol, genomic library, Clostridium, sequence analysis.
Recibido: enero 22 de 2006            Aceptado: mayo 02 de 2006
* QFUN. Universidad Nacional de Colombia. Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia. ** QFUN. MSc. Microbiología. Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia.
*** QFUN. MSc. PhD. Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia. Correo electrónico: dmontoyac@unal.edu.co
**** QFUN. PhD. Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia.
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INTRODUCCIÓN
Durante los aæos 90 se aislaron 13 cepas del gØnero Clostndium provenientes de diferentes muestras de suelos colombianos caracterizadas por producir solventes (acetona, butanol, etanol) en una concentración superior a la de cepas de referencia del mismo gØnero, y con capacidad para degradar polisacÆridos naturales que incluyen al­midón y carboximetilcelulosa (CMC) (Montoya et ál., 2000). Posteriormente se realizaron anÆlisis de taxonomía polifásica que incluyeron la secuenciación del gen 16S rARN, caracterización molecular por campo pulsado (PFGE), detección de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción amplificados (AFLP), hibridación ADN-ADN y pruebas bioquímicas y enzimáticas que sugirieron que las cepas mencionadas podrían constituir una especie nueva cercanamente rela­cionadas con Clostndium butyrícum (Montoya et ál.,2001; Jaimes etÆl., 2006; Suárezetál., 2006). Adicionalmente se determinó que cinco de las ce­pas tenían la capacidad de producir 1,3-propanodiol (1,3 PD) a partir de glicerol en una concentración mayor a la de tres cepas de refe­rencia del gØnero Clostrídium (CÆrdenas y Pulido, 2004) mediante una ruta bioquímica propia de al­gunos clostridios (figura 1). La cepa Clostrídium sp. IBUN 22A coincide con los subgrupos con ma-
yor capacidad celulolítica, solventogénica y de pro­ducción de 1,3-PD a partir de glicerol. Por esta razón se generó una librería genómica en Escherichia coli a partir de Clostrídium IBUN 22A, destinada a la bœsqueda de genes de interØs en clones con insertos de tamaæo superior a 500 pb.
A través de una estrategia de minería de da­tos se analizaron secuencias genómicas obtenidas con el propósito de identificar sectores codificantes de enzimas asociadas a procesos metabólicos de interØs comercial. Uno de los resultados mÆs rele­vantes fue la identificación de la secuencia parcial de uno de los genes involucrados en la síntesis de 1,3-PD. Así mismo se identificaron seis genes de mantenimiento celular con secuencias altamente similares a los genes equivalentes en otras espe­cies del gØnero Clostrídium.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas bacterianas y plÆsmidos. La cepa celulolítica Clostrídium sp. IBUN 22A, aislada de suelos colombianos (Montoya et ál., 2000), fue usa­da para la construcción de una librería genómica en E. coli XL1 BLUE con el vector de clonación pBluescript® II KS+/-, como lo describe Vargas et Æl. (2002). Adicionalmente, el clon PBS-25 con acti­vidad celulasa fue subclonado en Escherichia coli
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Figura 1. Ruta bioquímica de la asimilación de glicerol y producción de 1,3 Propanodiol en Clostrídium butyrícum. Se describen las enzimas implicadas en el proceso y sus genes identificados a la fecha (Raynaud etál., 2003).
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DH5á, obteniéndose así los clones PBSH-26 y PBSH-37 (Roncancio et Æl, 2005).
Secuenciación de clones representativos de la librería genómica y productos de subclonaje.
Todos los plÆsmidos fueron evaluados electroforØticamente y se seleccionaron para secuenciación aquellos cuyo tamaño de inserto fue­ra superior a 500 pb. Nueve plÆsmidos fueron seleccionados y extraídos con el kit Wizard® de Promega (tabla 1). La secuenciación se realizó por triplicado en las siguientes instituciones: ser­vicio de secuenciación automatizada de la UNAM (México), el Laboratorio de Genómica e Expressao de UNICAMP (Brasil) y MACROGEN (Corea), usando los primers M13, F y R. (F, 5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACGAC-3'; R, 5'-AGGAAACAGCTATGACCAT GATTAC-3'), T3 y
T7 (T3, S'-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-S1; T7, 51-TAATACGACTCACTATAGGG-31).
AnÆlisis bioinformÆtico de las secuencias de los insertos. Las secuencias depuradas fueron com­paradas contra la base de datos completa de Genbank 141.0 (Benson et Æl., 2005), al igual que contra bases de datos específicas de Clostridium acetobutylicum, C. botulinum A, C. difficile, C. perfringens ATCC 13124 y str. 13, C. tetani E88 y C. thermocellum ATCC 27405 almacenadas en el website de NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/), usando las aplicaciones BLASTN 2.2.8 y TBLASTX. Las secuencias traducidas en los seis marcos de lec­tura posibles fueron comparadas contra la base de datos de proteínas SwissProt 42.8 (Boeckmann et Æl.2003) usando BLASTX 2.2.8 desde el portal de NCBI y contra la base de datos UniProt 6.6
Tabla 1. Clones secuenciados y registrados en GenBank
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(Leinonen et ál., 2004). Por œltimo se extrajeron los marcos abiertos de lectura (ORFs) mÆs largos usando el programa getorf y plotorf de EMBOSS (Centro Internacional de BioinformÆtica del IBUN, www.bioinf.ibun.unal.edu.co; Rice et ál., 2000) y se confirmaron con Artemis v5 (Rutherford et ál., 2000), ORFfinder de NCBI (Wheeler et Æl., 2005). Los ORF mÆs largos se compararon nuevamente contra UniProt usando BLASTP. En caso de ha­llarse una semejanza superior al 70% con genes o proteínas conocidos, sumada a la detección de señales de transcripción en posición -10 o -35, RBS (secuencias de unión a ribosomas) o palíndromes de terminación, se consideró que la secuencia co­rrespondía con alta probabilidad a un gen. Las secuencias seleccionadas fueron registradas ma­nualmente en GenBank usando la herramienta BankIt (en línea).
RESULTADOS
Secuenciación de clones representativos de librería genómica y productos de subclonaje.
Se obtuvieron 25 secuencias entre 248 y 1546 pb. Se sometieron a GenBank nueve secuencias, en siete de las cuales se identificaron genes de housekeeping o de interØs para las rutas metabólicas de Clostridium (tabla 1).
Predicción del gen dhaB1 en el clon pBsIBUN22A-1. Se determinó que el inserto del clon pBsIBUN22A-1 tenía una longitud inicial de 851 pb. El análisis reveló que el ORF más largo estaba ubicado entre las posiciones 76 y 851 en sentido 51 3' (figura 2), con una región de 386 pb, con identi­dad de 99.74% respecto a la región codificante del gen dhaB1 de C. butyricum (E=1e-70) (figuras 3 y 4), con un sitio de unión a ribosoma localizado en­tre las posiciones 57 y 61, mientras que el resto de la secuencia exhibió una similaridad menor a una proteína transportadora de prolina y triptófano de­pendiente de sodio en Clostridium tetani (Brueggemann et Æl., 2003).
El alineamiento de la traducción en el segun­do marco de lectura del inserto de pBSIBUN 22A-1 con la secuencia aminoacídica de DhaB1 en TBLASTX presenta una región de 152 aminoáci­dos (aa) con identidad perfecta y valor (E=2e-77). Este resultado es sobresaliente, dado que el gen dhaB1 es el primero del operón 1,3-PD de C.
butyricum, y codifica para la enzima glicerol deshidratasa que permite la conversión de glicerol en 3-hidroxipropionaldehído en la ruta bioquímica de producción de 1,3 PD (Raynaud et ál., 2003). En este caso se identificó un sitio de unión al ribosoma (RBS) en las posiciones 57 a 61, hecho que permi­te predecir el gen con alta probabilidad y que sugiere la presencia del resto de los genes en la cepa nati­va en atención a que se ha demostrado que tiene la capacidad de producir 1,3 propanodiol a partir de glicerol. Se requieren estudios posteriores para es­tablecer la secuencia de los demÆs genes involucrados en la ruta de la cepa nativa, así como su organización física (tabla 1).
Detección de genes metabolismo básico o housekeeping. En el tercer marco abierto de lectu­ra del clon pBsIBUN22A-2 se halló una región con 78% de identidad con el gen codificante de la proteí­na NifN-B de Clostridium beijerinckii (GenBank AAS91670) entre las posiciones 81 y 782, y con un sitio de unión a ribosoma entre la posición 68 y 72 (Chen et ál., 2001). La calidad de los alineamientos obtenidos (E=3e-25) y el hecho de que la mayor par­te de los resultados de la bœsqueda sean homogØneos en otras especies de Clostridium per­miten predecir que esta secuencia codifica una proteína de 233 aa requerida para la biosíntesis del cofactor hierro-molibdeno (o hierro-vanadio) usado por nitrogenasas implicadas en la fijación de nitró­geno en bacterias (tabla 1).
En la secuencia del inserto del clon Gen22A-C100 entre la posición 20 y 127 se halló una región de 93% de identidad con parte del gen que codifica para el factor de elongación Tu de Clostridium perfringens str. 13 (Shimizu et ál., 2002), así como con el mismo gen de otras es­pecies de Clostridios. El factor Tu promueve la unión del aminoacil-tRNA al sitio A del ribosoma durante la biosíntesis de proteínas. Adicionalmen-te, se ubicó un palíndrome de terminación entre las posiciones 155 y 174 (tabla 1).
En el extremo 51 del inserto del clon 020801-30, entre las posiciones 2 y 112, se identificó un sector que guarda un 85% de identidad con una región de la enzima purina-nucleósido fosforilasa de Clostridium tetani E88 (GenBank NP 782010) y con otras del gØnero Clostridium. Esta enzima tie­ne la función de catalizar la reacción de formación
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Figura 2. Marcos abiertos de lectura detectados en el anÆlisis de la secuencia del clon pBsIBUN22A-1. Visualización obtenida por PLOTORF de Emboss (Rice et ál., 2000).
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Figura 3. Secuencia del inserto del clon pBS IBUN 22A-1 registrada en GenBank (registro AY968605). El sitio de unión al ribosoma (RBS) y el codón de inicio (en líneas punteadas) han sido definidos a partir de secuencias consenso de estos elementos en diferentes genes de C. butyrícum. La numeración positiva inicia en el primer nucleótido del codón de inicio. El rectángulo de línea continua delgada indica la región idéntica a dhaB1 de C. butyrícum.
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Figura 4. Salida de Blastp para el ORF mÆs largo identificado en la secuencia del clon pBsIBUN22A-1. En rojo la secuen­cia codificante de la proteína DhaB1 y en azul con menor identidad la secuencia del transportador de prolina y triptofano dependiente de sodio.
de a-D-ribosa 1-fosfato en el metabolismo de las purinas. Este resultado sugiere que la secuencia obtenida corresponde a parte del gen codificante para la proteína mencionada, por lo que fue some­tida a GenBank con el nœmero DQ225170. Adicionalmente en la región 3' del inserto del clon pBS25B se detectó una región de 121 pb con simi­litud del 67% a la misma proteína (purin-nucleósido fosforilasa DeoD) de Clostrídium tetani (tabla 1) (Brueggemann et ál., 2003).
En el inserto del clon pBS-25, en la región com­prendida entre las posiciones 29 y 430, se encontró una región con una identidad del 69% (E=6e-38) con respecto al gen completo que codifica para el dominio carboxi terminal de la proteína transcetolasa de Clostrídium thermocellum ATCC 27405 (GenBank ZP 00510628) y de 60% en el caso de la misma enzima en Clostrídium perfríngens str. 13 (GenBank: BAB80003) (Shimizu et ál., 2002). Se identificaron RBS entre la posición 17 y 22, y una seæal -10 del promotor entre las posiciones 8 y 12, así como un palíndrome de terminación entre los sitios 458 y 482, hechos que sugieren que la secuencia completa sí corresponde al gen de una transcetolasa posiblemente involucrada en la vía de las pentosas-fosfato, por lo que fue someti­da a GenBank con el nœmero DQ228721. Adicionalmente en el inserto del clon 020803-16 se detectó que la traducción de uno de los ORF mÆs largos presenta una similitud del 82% con el dominio de unión a piridina en transcetolasas de Clostrídium thermocellum y perfríngens (GenBank: ZP_00510628 y BAB80003), respectivamente. Con­firman la predicción de esta proteína el hallazgo de una seæal -10 del promotor entre las posiciones 21 y 26 (tabla 1) (Copeland et ál., 2005; Shimizu et ál., 2002).
En los insertos de los clones 011901-2 y 012901-20 (GenBank DQ223967 y DQ223968, res-
pectivamente) no se identificaron ORF representa­tivos.
DISCUSIÓN
La identificación o reconocimiento de genes es uno de los problemas mÆs importantes en la bio­logía molecular, que ha incrementado su complejidad debido al advenimiento de un gran nœmero de proyectos genoma. Las estrategias usualmente empleadas para resolver este proble­ma se dividen en dos tipos, una de las cuales emplea la estadística de composición de las secuen­cias mientras que la otra recae en la bœsqueda de similaridad en bases de datos (Shibuya y Rigoutsos, 2002). En este trabajo se utilizó la segunda estrate­gia y las secuencias fueron contrastadas teniendo en cuenta las características estructurales de los genes.
En los insertos de los clones pBsIBUN22A-2, DQ060835, 020801-30, pBs25, 020803-16, pBS25-B, fue posible identificar genes de mantenimiento celular por similaridad con genes descritos para es­pecies del gØnero Clostrídium. La detección de tales genes de metabolismo permite la exploración genómica de las cepas nativas, aunque se requie­re llevar a cabo pruebas bioquímicas y moleculares que demuestren la expresión y funcionalidad de estas enzimas en la cepa IBUN 22A.
La cepa colombiana Clostrídium sp. IBUN 22A ha demostrado la capacidad de fermentar glicerol hasta 1,3-PD, y los últimos análisis taxonómicos la ubican en el mismo nodo de las especies producto­ras de 1,3-PD como C. butyricum (SuÆrez et Æl., 2006). Cabe mencionar que Biebl y Spróer (2002) previamente demostraron que especies cercanamente relacionadas a la cepa nativa tienen la capacidad de metabolizar el glicerol y producir 1,3 propanodiol, como es el caso de algunas cepas
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de Clostridium diolis. La producción de este solvente en las cepas nativas sugiere la existencia de un sistema genético que regule la producción de 1,3-PD, de manera similar a la descrita por Raynaud et Æl., 2003, para Clostridium butyricum VPI1718 (2003).
La ruta de conversión de glicerol a 1,3-propanodiol involucra enzimas agrupadas en el reguión dha o en el operón 1,3-PD de acuerdo al organismo. Dos de ellas (glicerol deshidrogenasa y dihidroxiacetona kinasa) se encargan de convertir al glicerol en piruvato, produciendo así equivalen­tes NADH que son necesarios para la reducción del glicerol por medio de otras dos enzimas (glice­rol deshidratasa y 1,3-PD deshidrogenasa) (Sun et ál., 2003) (figura 1). El paso limitante en este pro­ceso es la conversión de glicerol en 3-hidroxipro-pionaldehído catalizado por la glicerol deshidratasa. En este paso se produce un radical intermediario que suele involucrar a la coenzima B12 como cofactor (Knietsch et ál., 2003). La glicerol deshidratasa DhaB1 de C. butyricum es una ex­cepción en dicha familia enzimática, ya que está compuesta por sólo una subunidad (gen dhaB1) y no requiere coenzima B12 como cofactor (Nakamura y Whited, 2003). El hallazgo de una secuencia casi idØntica a una glicerol deshidratasa en IBUN 22A tiene particular relevancia dado que de su expre­sión depende toda la ruta de producción de 1,3-PD, siendo interesante averiguar en estudios posteriores si es o no dependiente de coenzima B12, considerando que este es un costo adicional den­tro del proceso industrial de 1,3-PD (Raynaud et ál., 2003, Sun etál., 2003).
Se debe resaltar que la identificación de un gen del operón dha en IBUN 22A ademÆs de con­tribuir con la información sobre la cepa, abre las puertas para realizar mejoramiento de cualquiera de las cepas nativas aisladas junto con IBUN 22A, en las cuales se determinó productividad volumØtrica y rendimiento de 1,3-PD igual o supe­rior a ella (CÆrdenas y Pulido, 2004). Actualmente se adelanta el proceso de secuencia de todo el operón que regula la producción de 1,3 PD en va­rias cepas nativas y se planea realizar la caracterización de las enzimas involucradas en la ruta para optimizar la producción de este metabolito. En el futuro una de estas cepas podría ser usada para la producción industrial del solvente a partir de
efluentes con alto contenido de glicerol como aque­llos procedentes de las plantas de producción de biodiesel.
CONCLUSIONES
Los resultados de este trabajo demuestran la utilidad del anÆlisis de secuencias de insertos en librerías genómicas para el hallazgo de genes con aplicación industrial y permite proyectar la investi­gación básica hacia la rentabilización del proceso de producción de 1,3-PD.
AGRADECIMIENTOS
El desarrollo de este proyecto fue posible gra­cias al respaldo económico de Colciencias y la Universidad Nacional de Colombia dentro del mar­co del proyecto "Producción de 1,3 Propanodiol a partir de glicerol generado del proceso de produc­ción de biodiesel, empleando cepas nativas de Clostridium spp: estudio del operón, condiciones de producción por fermentación y su viabilidad econó­mica" (1101-12-17848), desarrollado por el Instituto de Biotecnología. Algunas de las secuencias fue­ron obtenidas por el Dr. Goncalo Guimaráes Pereira del Laboratorio de Genómica e Expressao, Depar­tamento de Genética e Evolucao del Instituto de Biología de la Universidad de Campiñas. Agrade­cemos la colaboración del Dr. Emiliano Barreto y Andrés Pinzón por su soporte en el análisis bioinformÆtico.
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