Predicción computacional y confirmación experimental de proteínas de superficie en mycobacterium tuberculosis H37Rv

Abstract

La predicción computacional de la localización subcelular de proteínas micobacterianas (particularmente proteínas de superficie) es un importante paso en la anotación y búsqueda de proteínas como nuevos blancos para fármacos y vacunas. En este trabajo, se utilizó una aproximación bioinformática específica (herramientas basadas en características), que a partir del proteoma de la cepa H37Rv de Mycobacterium tuberculosis permitió la identificación de proteínas secretadas por diferentes vías. Posteriormente, se realizó una aproximación general (localizadores generales) para la determinación de la localización subcelular de dichas proteínas, determinando finalmente su topología transmembranal. Este mismo análisis bioinformático fue realizado para 100 proteínas previamente corroboradas por proteómica como proteínas de superficie. Un total de 825/3924 proteínas fueron identificadas de manera exclusiva en la aproximación específica utilizada, de las cuales un total de 376 presentaron anclaje transmembranal y fueron clasificadas en la membrana plasmática por cualquiera de localizadores generales utilizados. Los resultados obtenidos por predicción computacional, fueron validados mediante fraccionamiento subcelular y microscopía inmunoelectrónica (IEM) para un conjunto de 14 proteínas seleccionadas, incluyendo cuatro controles positivos derivados de estudios realizados previamente, ocho proteínas candidatas y dos controles negativos. A través de esta metodología, se logró validar 10 proteínas por IEM (seis identificadas también por immunoblotting), presentes en la superficie celular del bacilo. Adicionalmente, el control negativo citoplasmático fue observado en este compartimento. Los resultados obtenidos soportan el uso de metodologías computacionales para la identificación a priori de proteínas de superficie. / Abstract. The computational prediction of protein subcellular localization (particularly of surface proteins) is an important step in the annotation and search for drug and vaccine mycobacterial protein targets. In this study, the proteome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv was examined using a specific bioinformatics approach (feature-based tools) to identify proteins that are potentially secreted via different secretory pathways and a general bioinformatics approach to predict the subcellular localization and transmembrane topology of such proteins. This same bioinformatics strategy was applied to 100 proteins whose surface localization has been confirmed by proteomics studies. The specific approach identified a total of 825 out of 3924 proteins as being surface proteins and the general localizers predicted that 376 of these proteins contained a transmembrane anchor site and were translocated to the mycobacterial cell membrane. Our computational predictions were experimentally validated by subcellular fractioning and immunoelectron microscopy (IEM) for a set of 14 preselected proteins that included 4 positive controls previously identified, 8 predicted surface/secreted proteins and 2 negative controls. IEM analyses indicated that 10 of our preselected proteins were secreted to the mycobacterial cell surface. The results support the use of computational methodologies as a high-throughput screening strategy to identify cell surface and secreted proteins on mycobacteria.