Desarrollo de una metodología molecular para el diagnóstico rápido de virus que están infectando el tomate en Colombia

Abstract

Las enfermedades virales se han constituido en una de las principales causas de pérdidas económicas en los cultivos de tomate a nivel mundial. Los objetivos de este trabajo fueron identificar virus ARN pertenecientes a los géneros Crinivirus, Potexvirus, Tospovirus, Torradovirus, Potyvirus, Cucumovirus y Tobamovirus, y virus ADN del género Begomovirus en cultivos de tomate, con el fin de diseñar sondas para emplearlas como herramientas de diagnóstico viral basado en la hibridación de ácidos nucleicos. Para cumplir este objetivo, en el periodo 2008- 2009 en Cundinamarca, Santander, Valle del Cauca, Antioquia y Boyaca; y en el periodo 2011 en Risaralda y Caldas se colectaron muestras de tomate con sintomatología viral. Se realizó extracción de ADN y ARN total del tejido vegetal y mediante ensayos de PCR y RT-PCR con iniciadores específicos se detectaron los diferentes virus ARN y ADN. Finalmente, para conocer la identidad molecular de los virus detectados, estos fueron clonados, secuenciados y analizados con herramientas bioinformáticas. Los resultados de nuestros análisis mostraron que en las muestras recolectadas no se evidenció la presencia de virus de los géneros Begomovirus monopartita, Crinivirus, Potexvirus, Tospovirus, Torradovirus y Potyvirus. Durante el análisis se identificó la presencia de los virus Cucumber mosaic virus(Cucumovirus) en cultivos de tomate chonto y Tomato mosaic virus (Tobamovirus) en tomate cherry en muestras recolectadas en el departamento del Valle del Cauca, donde ambos mostraron identidades mayores de 98% con aislamientos virales similares de otras latitudes. De acuerdo a lo reportado a la fecha este es el primer trabajo donde se reporta la presencia del Tomato mosaic virus en cultivos de tomate cherry en Colombia. Además se identificó la presencia del begomovirus bipartita Potato yellow mosaic virus (PYMV) en muestras recolectadas en los departamentos de Risaralda y Caldas cuya identidad molecular se determinó por hibridación de ácidos nucleicos tipo dot-blot. En este estudio se pudo evidenciar la mezcla de infecciones entre CMV- PYMV y ToMV-PYMV. Finalmente, se estandarizaron las condiciones de PCR y dot blot para detectar los virus Tobamovirus, Cucomovirus y Begomovirus, los cuáles actualmente están afectando el cultivo de tomate.

//Abstract: Viral diseases have become a major cause of economic loss in tomato crops worldwide. The aim of this research was to identify if RNA virus belonging to the genera Crinivirus, Potexvirus, Tospovirus, Torradovirus, Potyvirus, Cucumovirus, Tobamovirus and DNA virus to the genera begomovirus, in order to design probes to employed to viral diagnosis based on nucleic acid hybridization. In order to get this goal, during 2008-2009 in Cundinamarca, Santander, Valle del Cauca, Antioquia, Boyacá and in the period 2011 in Risaralda and Caldas samples of tomato leaves with viral symptoms were collected. DNA and total RNA extraction were done, then PCR and RT-PCR assays were performed using specific primers for each virus RNA and DNA, and finally these were cloned, sequenced and analyzed with bioinformatics tools in order to determine its molecular identity. In the samples analyzed there was no presence of viruses belonging to the genera Begomovirus (monopartite), Crinivirus, Potexvirus, Tospovirus, Torradovirus and Potyvirus. By the other hand this our analysis could identified the presence of the virus Cucumber mosaic virus (Cucumovirus) in “chonto” tomato and Tomato mosaic virus (Tobamovirus) in cherry tomato which both of them showed 98% identity with other viral isolates affecting tomate crops previously identified in other regions of the world. To our knowledge this is the first study reported the presence of Tomato mosaic virus in cherry tomato crops in Colombia. Addition identified the bipartite begomoviruses Potato yellow mosaic virus (PYMV) in samples collected in Caldas and Risaralda whose molecular identity was determined by nucleic acid hybridization (dot-blot). In this study could evidence mixed infections between CMV-PYMV and ToMV-PYMV. Finally, conditions were standardized PCR and Dot-blot to identify the virus Tobamovirus, Cucumovirus and Begomovirus,wich are currently affecting the tomato crop.