Establecimiento de un sistema diagnóstico para la detección de ralstonia solanacearum y diferenciación genética utilizando marcadores moleculares rapd

Abstract

Con el propósito de identificar de manera rápida y precisa el agente causal de la marchitez bacteriana de la papa (Ralstonia solanacearum) en tubérculos asintomáticos, se ha desarrollado una prueba diagnóstica basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando iniciadores específicos para amplificar una región 16S rDNA de 292 pb. Para ello se aisló la bacteria a partir de tubérculos de papa y frutos de plátano, empleando técnicas de cultivo, prueba inmunológica y molecular ELISA-NCM y PCR, respectivamente. En tubérculos asintomáticos la PCR detectó la presencia de R. solanacearum en contraste con la ELISA-NCM que no detectó al patógeno. El análisis de polimorfismos de amplificación al azar de ADN (RAPD) permitió diferenciar y agrupar las procedencias de R. solanacearum por regiones geográficas y razas bacterianas, sugiriendo que existen diferencias entre las colectas de acuerdo con su lugar de origen, indicando alta variabilidad genética. Los resultados mostraron que la PCR es una prueba sensible y específica para la detección de R. solanacearum y por lo tanto puede ser implementada como un método de control del patógeno en programas de producción de semilla y certificación de áreas libres de la enfermedad. Según el origen geográfico de las muestras, el patógeno mostró ser genéticamente heterogéneo, dificultando su control en regiones colombianas con problemas fitosanitarios con R. solanacearum en cultivo de papa. Palabras clave: marchitez bacteriana, moko, PCR-16S ADNr, ELISA-NCM, PCR-RAPD.

A polymerase chain reaction-based diagnostic test (PCR) has been developed for amplifying a región and obtaining a 292 bp product by using specific 16S rDNA primers for the rapid and precise identification of the causative agent (Ralstonia solanacearum) of bacterial withering of potato in asymptomatic tubers. The bacteria was isolated from potato tubers and banana fruit using culturing techniques and immunological and molecular ELISA-NCM and PCR tests, respectively. PCR detected the presence of R. solanacearum on asymptomatic tubers by contrast with ELISA-NCM which did not detect this pathogen. Analysing random amplified polymorphic DNA (RAPD) led to differentiating and grouping R. solanacearum by geographical región and bacterial strain, suggesting that differences exist amongst existing collections according to their place of origin, presenting high genetic variability. The results showed that PCR is a sensitive and specific test for detecting R. solanacearum and can therefore be implemented as a method for controlling this pathogen in seed production and certification programmes in áreas free of the disease. The pathogen has been shown to be genetically heterogeneous according to the samples' geographical área thereby hampering control in áreas of Colombia experiencing phytosanitary problems with R. solanacearum in potato crops Key words: bacterial withered, moko, PCR-16S rADN, ELISA-NCM, PCR-RAPD.