Identificación y caracterización de la Nicotinamida Mononucleótido Adenilil Transferasa (NMNAT) en Trypanosoma cruzi: enzima clave en el metabolismo del NAD+

Abstract

Trypanosoma cruzi es el causante de la enfermedad de Chagas. El aumento reciente de esta enfermedad, se debe en gran medida al desarrollo de resistencia por parte del parásito a las drogas comúnmente usadas contra este. Las NMNAT (EC: 2.7.7.1) catalizan un paso clave en la biosíntesis del NAD+. Dado que el NAD+ es fundamental para sostener procesos fisiológicos basales en T. cruzi, garantizar su supervivencia en el hospedero y contribuir a los mecanismos de resistencia a drogas, la identificación de la NMNAT de T. cruzi (TcNMNAT) es primordial para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas contra la enfermedad de Chagas; partiendo del conocimiento de la bioquímica del parásito. En este estudio se buscaron secuencias candidato para la TcNMNAT mediante programas de alineamiento, usando las bases de datos TritrypDB y PDB. Se generaron modelos tridimensionales de la proteína correspondiente, y un mutante delecional de la misma, en el servidor I-TASSER. La secuencia identificada se amplificó y clonó en el vector de expresión pET-100. La proteína 6xHisTcNMNAT fue expresada en E. coli y purificada parcialmente empleando cromatografía de afinidad. De esta proteína se confirmó su actividad enzimática y se determinaron sus constantes cinéticas correspondientes; todo esto mediante ensayos enzimáticos directos empleando RPHPLC. En este trabajo se identificó un marco de lectura para una NMNAT en el genoma de T. cruzi, cuya proteína recombinante presenta actividad adenilil transferasa. Esto representa la primera identificación y caracterización cinética de una NMNAT en Trypanosoma cruzi; lo cual constituye un primer paso en la comprensión del metabolismo del NAD+ en este parásito, dando nuevos aportes al conocimiento del metabolismo del NAD+ en parásitos intracelulares.

Abstract: Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease. Increase in the incidence rates of such illness, is due to resistance by the parasite to commonly used drugs against it. The NMNAT (EC: 2.7.7.1) catalyze a key step in the biosynthesis of NAD+. Since NAD+ is essential for sustaining basal physiological processes in T. cruzi, ensuring its survival in the host, and also contributes to drug-resistance mechanisms, the identification of a T. cruzi NMNAT (TcNMNAT) becomes essential to develop new therapeutic strategies against Chagas disease; departing from a comprehensive knowledge of this parasite´s biochemistry. In the present study, TcNMNAT candidate sequences were searched by means of alignment programs and data bases such as TritrypDB and PDB. Three dimensional models of the resultant protein and its deletional mutant were generated by the server ITASSER. The identified candidate sequence was amplified and cloned into the expression vector pET-100; and the corresponding recombinant protein (6xHisTcNMNAT) was expressed in E. coli and partially purified using affinity chromatography. Enzymatic activity and the equivalent kinetic constants were determined for this protein, through direct enzymatic assays using RP- HPLC. In this project the ORF for an NMNAT was identified in the genome of T. cruzi and its recombinant protein shows adenylyltransferase activity, which represents the first identification and characterization of a NMNAT in Trypanosoma cruzi. This finding constitutes a first approach in the understanding of this parasite´s NAD+ metabolism, contributing also to the understanding of NAD+ metabolism in intracellular parasites.