Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares

Abstract

El “pan de abejas” es un producto que las abejas elaboran en el interior de las colmenas a partir del polen floral, posee características de interés en nutrición humana. Estudios han demostrado que la transformación del polen apícola a pan de abejas es producto de la fermentación desarrollada por microorganismos entre los que se destacan bacterias y levaduras. Las levaduras ha sido el grupo menos investigado. El presente estudio planteó el objetivo general de identificar los géneros y las especies de levadura involucradas en la transformación de polen en pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares. Metodología. Se colectaron muestras de pan de abejas de Apis mellifera a partir de celdas individuales y se separaron de acuerdo con el nivel aproximado de llenado de los alveolos, así: 1. ≤ 2 mm de profundidad, 2. ≤10 mm, 3. de ≤15 mm y 4. ≥ 15mm. Se complementó el estudio mediante un muestreo exploratorio de pan de abejas en pote de colonias de la Tribu Meliponini, correspondientes a los géneros Scaptotrigona, Plebeia y Paratrigona, así como de la especie Tetragonisca angustula. Las muestras de pan de abejas y polen de pote fueron procesadas mediante la técnica de siembra directa. Los cultivos fueron incubados a 35°C durante 48 horas. Las placas con crecimiento se resembraron, y se incubaron a 35°C durante 48 horas. Este procedimiento se repitió hasta obtener colonias en cultivo puro. Las formas levadurales fueron caracterizadas en cuanto al perfil bioquímico mediante el sistema Vitek2® y técnicas moleculares por medio de PCR y de la secuenciación del ADN genómico de cada una de las cepas a las cuales se les amplificó un fragmento ITS de la región 5,8S ribosomal. Resultados. Se identificó en el pan de abejas de A.mellifera la presencia de los géneros Candida, Kodamaea Metschnikowia y Zygosaccharomyces. Para los dos últimos se presentó relación entre la detección y estadios específicos de llenado alveolar. También se identificaron levaduras relacionadas exclusivamente con el pan de abejas de la Tribu Meliponini como Starmerella meliponinorun, Candida versatilis y Starmelera bombicola. Igualmente se presentan levaduras asociadas por primera vez con los productos de las abejas Yarrowia lipolytica. Los resultados en los perfiles bioquímicos del sistema Viek2® presentan diferencia en las levaduras para la asimilación de compuestos según el origen entomológico y según el volumen de llenado alveolar para el caso de la especie Apis mellifera, lo que permite un acercamiento a la cinética ocurrida en la maduración del pan de abejas. Como conclusión general del estudio se indica que existen diferencias entre las especies de levaduras presentes en el pan de abejas de Apis mellifera y abejas de la Tribu Meliponini, asimismo, se identifica la presencia de diferentes tipos de levadura según el volumen de llenado del alveolo. También se reconoce la importancia del género Candida en el proceso de maduración del pan de abejas, dado se recuperó en un alto número de casos. El presente trabajo representa un aporte importante para el entendimiento del proceso de transformación del polen apícola al pan de abejas.

Abstract. When bees collect pollen, they store it in individual comb cells and this creates a pellet with layers as different loads are compacted in it. The pollen undergoes a fermentation process that creates “bee bread” which has been found to have interesting properties for human nutrition. Previous studies have shown that several bacteria and yeasts mediate this transformation. Out of these, the yeasts group has been the least investigated. The aim of the present study was to identify the yeasts genres and species involved in this process by traditional and molecular means. Methodology. Apis mellifera bee bread samples were collected from individual comb cells and were classified according to the height of the pellet (which is interpreted as a filling level) as follows: 1. ≤ 2 mm deep, 2. From 3 to 10 mm deep, 3. From 11 to 15 mm deep and 4. Greater than 15 mm deep. The study was complemented using an exploratory sampling of bee bread from colonies of the Meliponini Tribe (Stingless bees). The sampled genera were Scaptotrigona, Plebeia and Paratrigona, and the Tetragonisca angustula species. All the bee bread samples were processed using the direct culture technique. The cultures were incubated at 35ºC for 48 hours. The dishes that showed growth were cultured again and incubated at the same temperature and for the same length of time. This process was repeated until colonies in pure culture were obtained. The yeast forms were characterized according to their biochemical profile using the Vitek2® system and by means of genomic DNA PCR and sequencing for each one of the strains obtained. The genome fragment amplified corresponded to the 5,8S – ITS region. Results. The presence of Candida, Kodamaea, Metschnikowia and Zygosaccharomyces yeast genera in A. mellifera bee bread was found. For the latter two, a relation between their presence and a specific cell filling level was detected. Yeasts that were exclusively in the bee bread from colonies of the Meliponini Tribe were also identified. These belonged to the Starmerella meliponinorun, Candida versatilis and Starmelera bombicola species. Likewise, there was identified for the first time in bee bread the yeast species Yarrowia lipolytica. The results from the biochemical profiles of Vitek2® show a difference in the yeasts for the assimilation of compounds according to the entomological origin and for the cell filling level on A. mellifera, which allows to better understand the kinetics involved on the maturation of bee bread. Discussion. On this study we concluded that there are differences among the yeasts species present on bee bread from A. mellifera and from colonies of the Meliponini Tribe. There are also specific yeasts according to the cell filling level. The importance of the Candida genera on the bee bread maturation process is also recognized, due to the fact that it was identified in a high number of cases. The present study represents an important contribution for the understanding of the transformation process from pollen to bee bread.