En este artículo se presentan los resultados del desarrollo y validación de una metodologíaanalítica por cromatografía líquida de alta eficiencia con detector de arreglode diodos (HPLC-DAD) para la cuantificación de cafeína; se utilizó una columnaC18 con detección UV a 273 nm y una fase móvil compuesta por agua/acetonitrilo(80:20 v/v) de modo isocrático. Las características de desempeño evaluadas permitieroncomprobar que existe una adecuada selectividad, una linealidad entre 0,5 y 50ug/mL, con una precisión expresada como RSD menor a 2%, un porcentaje de recuperacióndel 99,9% y unos límites de detección y cuantificación para el método de2,99 y 2,69 ng/mL, respectivamente. El método propuesto es útil para determinar elperfil de permeación bucal de la cafeína mediante un estudio in vitro con celdas deFranz empleando membrana bucal porcina.This paper presents the results of the development and validation of an analyticalmethodology through high performance liquid chromatography with a diode arraydetector (HPLC-DAD) for the quantification of caffeine, using a C18 reverse phasecolumn with UV detection at 273 nm and a mobile phase consisting exclusively ofwater/acetonitrile (80:20 v/v). The evaluated performance characteristics allowed toverify that there is an adequate selectivity, a linearity between 0.5 and 50 g/mL, withprecision expressed as RSD in less than 2%, a recovery rate of 99.9%, and limits ofdetection and quantification for the method of 2.99 and 2.69 ng/mL respectively. Theproposed method is useful for determining the oral permeation profile of caffeine byan in vitro study with Franz cells using porcine buccal membrane.