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dc.rights.licenseAtribución-NoComercial 4.0 Internacional
dc.contributorSoto Ospina, Carlos Yesid
dc.contributor.authorLeón Torres, Andrés Felipe
dc.date.accessioned2019-07-03T10:15:11Z
dc.date.available2019-07-03T10:15:11Z
dc.date.issued2018-09-05
dc.identifier.urihttps://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/69048
dc.description.abstractEl éxito de Mycobacterium tuberculosis como patógeno se fundamenta en su capacidad de evadir la respuesta inmune del hospedero, sobreviviendo dentro de los macrófagos. En estas células, la micobacteria reside en fagosomas que exhiben una variedad de actividades antimicrobianas como pH ácido, especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (RNS), péptidos antimicrobianos, hidrolasas ácidas, bajo contenido de micronutrientes, y concentraciones no fisiológicas de iones de metales pesados. En este escenario hostil, los transportadores activos de cationes, como las ATPasas tipo P1B, juegan un papel relevante en la homeostasis iónica de la bacteria, al estar relacionados con la desintoxicación de estos metales, y con la respuesta al estrés redox. En el caso de M. tuberculosis, algunas ATPasas tipo P1B se han descrito como factores de virulencia, debido a su papel en la adaptación de la micobacteria al ambiente intracelular. En este orden de ideas, resulta interesante conocer la relación entre la actividad de las ATPasas tipo P1B y las condiciones de estrés que M. tuberculosis soporta durante la infección, con el fin de evaluar el potencial de estos transportadores de membrana en la viabilidad de M. tuberculosis. Para cumplir con este objetivo, el presente trabajo tuvo tres enfoques de estudio diferentes orientados a tener una visión del posible papel de las ATPasas tipo P1B en respuesta a algunas condiciones de estrés que simulan parcialmente el ambiente del fagosoma en el que reside M. tuberculosis. El primero, es el análisis transcripcional de las ATPasas tipo P1B bajo algunas condiciones de estrés al que M. tuberculosis se expone durante la infección. El segundo es la búsqueda de los posibles reguladores transcripcionales de estas ATPasas tipo P1B y la evaluación de su transcripción bajo las mismas condiciones de estrés, para así aproximarse a los potenciales mecanismos de regulación. Finalmente, una aproximación funcional de las tres Cu+ ATPasas putativas de M. tuberculosis, las que representan cerca de la mitad de ATPasas transportadoras de metales pesados en la micobacteria y cuya función se desconoce. Para su análisis se realizó una caracterización funcional de la actividad enzimática de estas tres proteínas, incluyendo análisis bioinformáticos, manipulaciones genéticas y de biología molecular, y finalmente un componente bioquímico para responder a los objetivos propuestos. Se encontró que todas las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis tienen una activación a nivel transcripcional en respuesta a las diferentes condiciones de estrés, como exposición a altas concentraciones de cationes de metales pesados, agentes de estrés oxidativo y nitrosativo, e hipoxia. El análisis transcripcional con cationes de metales pesados mostró que la transcripción de los genes ctpA, ctpG, y ctpV se activa en presencia de Cu2+, ctpC por Zn2+, ctpG por Cd2+ y ctpJ por Co2+. Agentes de estrés oxidativo y nitrosativo activaron la transcripción de los genes ctpA, ctpB, y ctpD, mientras que la hipoxia estimuló la expresión de ctpB y ctpC. Los anteriores resultados muestran que las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis se activan con la presencia de cationes de metales pesados, asociándose con el transporte estos metales y en su desintoxicación celular. También se pudo concluir que estas ATPasas se asocian con la respuesta al estrés redox e hipoxia, ayudando a la célula a responder a estas condiciones adversas. Los resultados del análisis transcripcional de los posibles reguladores transcripcionales de las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis, mostraron una respuesta concertada entre la activación de la transcripción del regulador y la ATPasa tipo P1B, lo que significa que los genes de los reguladores transcripcionales propuestos (rv0818, rv2250c, sigC, rv0324, sigH, rv0238, cmtR, nmtR, y csoR) aumentan sus niveles de expresión en respuesta a las mismas condiciones de estrés previamente establecidos para las ATPasas tipo P1B reguladas. Resulta interesante que M. tuberculosis exprese tres Cu+ ATPasas putativas, de las que se desconoce su función biológica. Nuestra hipótesis es que no se trata de sistemas redundantes de extrusión de cobre, sino que se trata de sistemas independientemente controlados que funcionan bajo condiciones metabólicas particulares de la micobacteria. Los análisis funcionales permitieron establecer que, cómo se esperaba, las tres enzimas tienen al Cu+ como sustrato. Los parámetros cinéticos de estas enzimas se determinaron usando ensayos enzimáticos de actividad Cu+ ATPasa y transporte de Cu+, permitiendo establecer que CtpA y CtpB se relacionan con enzimas encargadas de metalar proteínas extracitoplasmáticas, en tanto que CtpV se relaciona con la desintoxicación de Cu+, necesaria cuando los niveles de cobre intracelular sobrepasan el límite requerido y se vuelven deletéreos para la célula. El conjunto de resultados de este trabajo sugiere que las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis juegan un papel importante en la respuesta a las condiciones de estrés que la micobacteria enfrenta durante la infección, incluyendo altas concentraciones de metales pesados, estrés redox y bajas tensiones de oxígeno.
dc.description.abstractAbstract The success of Mycobacterium tuberculosis as pathogen is based on its ability to evade the host immune response. The bacterium resides inside macrophage phagosomes under an antimicrobial environment, including acid pH, reactive oxygen (ROS) and nitrogen (RNS) species, antimicrobial peptides, acid hydrolases, low micronutrient availability, and non-physiological concentrations of heavy metal cations. In this hostile scenario, membrane transporters such P1B-type ATPases, involved in cation detoxification and response to redox stress, are relevant to survive. Particularly, some mycobacterial P1B-type ATPases have been described virulence factors, due to their role in the adaptation of the mycobacterium to the intraphagosomal environment. To evaluate the potential of P1B-type ATPases in the bacterial virulence, it is important to know the relationship between these membrane transporters and the stress conditions that M. tuberculosis faces during infection. To achieve this goal, this work had three different study approaches. The first one was the transcriptional analysis of P1B-type ATPases under stress conditions that mimic the hostile environment inside phagosomes. The second was the identification of possible transcriptional regulators controlling P1B-type ATPases, by evaluating their transcription behavior under the stress conditions, in an effort to approach to the regulatory mechanisms of P1B-type ATPases. Finally, to gain a better understanding of the possible role of these transporters, the study focused on the 3 putative M. tuberculosis Cu+ ATPases. Those are about a half of the heavy metal transporting ATPases present in the mycobacteria, and all of them are without functional characterization. This characterization was made including, bioinformatic analysis, genetic and molecular biology manipulations, and a biochemical analysis Our analysis showed that all P1B-type ATPases of M. tuberculosis are overexpressed in response to different stress conditions, including high concentrations of heavy metal cations, oxidative and nitrosative stress, and hypoxia. The transcriptional analysis with heavy metal cations showed that the transcription of ctpA, ctpG, and ctpV is activated with Cu2+, ctpC with Zn2+, ctpG with Cd2+, and ctpJ with Co2+. Additionally, oxidative and nitrosative stress promotes transcription of ctpA, ctpB, and ctpD, and hypoxia promotes expression of ctpB and ctpC. This suggests that M. tuberculosis P1B-type ATPases are pivotal in the response to high concentration of heavy metal cations, which is in agreement with their canonical transport/detoxification function. Also, these ATPases are related with the response to redox stress and hypoxia, helping the pathogen to face those adverse conditions. The transcriptional analysis of the possible transcriptional regulators controlling P1B-type ATPases, showed a similar transcriptional response between the transcription regulator and the P1B-type ATPases. The genes of the proposed transcriptional regulators (rv0818, rv2250c, sigC, rv0324, sigH, rv0238, cmtR, nmtR, and csoR) increased their expression in response to the same stress conditions that the stimulated the expression of the P1B-type ATPases. Interestingly, M. tuberculosis possesses three putative Cu+ ATPases. Our hypothesis is that these are not redundant copper extrusion systems, instead, are independently controlled systems responding to specific metabolic conditions. The functional analyzes of those three proteins confirmed that Cu+ is the substrate of the three enzymes. The kinetic parameters determined by enzymatic assays, including Cu+ ATPase activity and Cu+ transport, suggest that CtpB and CtpA are related to enzymes involved in metalation of periplasmic proteins. In contrast, CtpV is homologue to enzymes involved in Cu+ detoxification. The set of results presented in this work suggests that M. tuberculosis P1B-type ATPases play an important role in the mycobacterial response to stress conditions faced during infection.
dc.format.mimetypeapplication/pdf
dc.language.isospa
dc.relation.ispartofUniversidad Nacional de Colombia Sede Bogotá Facultad de Ciencias Departamento de Química
dc.relation.ispartofDepartamento de Química
dc.rightsDerechos reservados - Universidad Nacional de Colombia
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
dc.subject.ddc57 Ciencias de la vida; Biología / Life sciences; biology
dc.titleRespuesta de las ATPasas tipo P1B a las condiciones de estrés en Mycobacterium tuberculosis
dc.typeTrabajo de grado - Doctorado
dc.type.driverinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesis
dc.type.versioninfo:eu-repo/semantics/acceptedVersion
dc.identifier.eprintshttp://bdigital.unal.edu.co/70467/
dc.description.degreelevelDoctorado
dc.relation.referencesLeón Torres, Andrés Felipe (2018) Respuesta de las ATPasas tipo P1B a las condiciones de estrés en Mycobacterium tuberculosis. Doctorado thesis, Universidad Nacional de Colombia - Sede Bogotá.
dc.rights.accessrightsinfo:eu-repo/semantics/openAccess
dc.subject.proposalMycobacterium tuberculosis
dc.subject.proposalATPasas tipo P1B
dc.subject.proposalCu+ ATPasas
dc.subject.proposalTransporte iónico
dc.subject.proposalMetales pesados
dc.subject.proposalReguladores Transcripcionales
dc.subject.proposalCu+-ATPases
dc.subject.proposalP1B-type ATPases
dc.subject.proposalIon transport
dc.subject.proposalHeavy metal cations
dc.subject.proposalTranscriptional regulator
dc.type.coarhttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06
dc.type.coarversionhttp://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa
dc.type.contentText
dc.type.redcolhttp://purl.org/redcol/resource_type/TD
oaire.accessrightshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2


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