La Hemofilia B es un trastorno de la coagulación con patrón de herencia recesiva ligada al X, causado por la deficiencia de FIX en plasma debido a variantes patogénicas en el gen F9. En Colombia, la HB se considera una enfermedad huérfana y de alto costo, con un reporte para el año 2017 de 362 varones en total. En este estudio se incluyeron 20 pacientes masculinos no relacionados con edades entre 5 y 68 años, pertenecientes a los programas de tratamiento Integral de Hemofilia en diferentes instituciones hospitalarias del país. Se realizó aislamiento de ADN en sangre periférica, posteriormente se realizó una reacción de PCR para los 8 exones, limites exón-intrón, las regiones UTR 5’ y 3’ del gen F9, verificación mediante electroforesis en gel de agarosa, y secuenciación Sanger. Los datos obtenidos se compararon con la secuencia de referencia y las variantes encontradas se cotejaron con bases de datos internacionales y literatura científica. Se identificaron las mutaciones en todos los pacientes analizados, siendo 15 mutaciones en total, ya que una misma mutación se detectó en varios pacientes. De ellas, ocho son variantes tipo missense, tres tipo nonsense, una mutación en la región UTR 3’, dos grandes deleciones 50pb y una sustitución intrónica que afecta el splicing. Todas estas variantes han sido reportadas previamente en la literatura, a excepción de la deleción de los exones 3 y 4 presente en un paciente, que no se encuentra reportada en las bases de datos internacionales. Siete pacientes presentan una mutación en IVS5+13 que afecta el splicing, siendo la frecuencia de mutación en splicing mas alta reportada en una serie de pacientes con hemofilia B (35%) y dos pacientes no relacionados presentaron la misma mutación missense. La correlación genotipo-fenotipo observada coincide con la reportada en la literatura con excepción de un paciente, con HB leve que posee una variante tipo missense asociada en la literatura a fenotipo moderado. En este primer estudio, se evidencia el amplio espectro mutacional en F9, lo cual se refleja en el comportamiento clínico de la enfermedad (severidad, presencia de inhibidores) y resalta la necesidad de realizar el análisis mutacional en todos los casos, para poder identificar mujeres portadoras y brindar un adecuado asesoramiento genético. En este trabajo realizado en el país, se reportan las primeras mutaciones en población colombiana con Hemofilia B.Abstract: Hemophilia B is a coagulation disorder with an X-linked recessive inheritance pattern, caused by FIX deficiency in plasma due to pathogenic variants in the F9 gene. In Colombia, HB is considered an orphan and high cost disease, with a report for 2017 of 362males in total. This study included 20 unrelated male patients aged between 5 and 68 years, belonging to the HB program in different hospital institutions in the country. DNA isolation was performed in peripheral blood, then a PCR reaction was performed for the 8 exons, exon-intron limits, the 5'and 3' UTR regions, verification by agarose gel electrophoresis, and Sanger sequencing. The data obtained was compared with the reference sequence and the variants found were compared with international databases and scientific literature. Mutations were identified in all patients, being 15 mutations in total, since the same mutation was detected in several patients. Eight of them are missense types, three nonsense types, one mutation in the 3'UTR region, two large deletions 50pb and one intron substitution that affects the splicing. All these variants have been previously reported in the literature, except for the deletion of exons 3 and 4 present in one patient, which is not reported in international databases. Seven patients have a mutation in IVS5+13 that affects splicing, being the frequency of mutation in splicing higher reported in a series of patients with hemophilia B (35%), and two unrelated patients have the same missense mutation. The genotype-phenotype correlation observed coincides with that reported in the literature with the exception of one patient who has a mild HB, has a missense type variant associated in the literature with a moderate phenotype. In this first study, the broad mutational spectrum in F9 is evidenced, which is reflected in the disease’s clinical behavior (severity, presence of inhibitors) and highlights the need to perform the mutational analysis in all cases, in order to be able to identify carrier women and provide adequate genetic counseling. In this work done in the country, the first mutations in Colombian population with Hemophilia B are reported.