Caracterización de un CAR expresado en células del sistema inmune, que potencialmente tenga la capacidad de reconocer, con alta sensibilidad y especificidad la integrina αVβ6 sobre células tumorales que la expresen
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Resumen
El presente estudio tuvo como objetivo diseñar y caracterizar funcionalmente un receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido contra la integrina αvβ6, combinando aproximaciones in silico e in vitro.
Inicialmente, se diseñaron dos dominios de reconocimiento modificados con el péptido PUI, un scFv y un sybody. Los análisis computacionales mostraron que el scFv modificado conserva una estructura estable y presenta una afinidad teórica elevada hacia la integrina αvβ6. Por su parte, el sybody mostró experimentalmente una afinidad en el rango nanomolar (KD ≈ 1.53 × 10⁻⁷ M), con cinética de unión favorable determinada por resonancia de plasmones superficiales, motivo por el cual fue seleccionado como dominio de reconocimiento del CAR DUI-28ζ, un CAR de segunda generación con dominios intracelulares CD28-CD3ζ.
El CAR fue expresado transitoriamente en PBMCs humanos sin purificación previa, logrando una transfección eficiente confirmada por microscopía de fluorescencia y análisis estadístico (p < 0.001). El análisis citométrico reveló un aumento en la intensidad de expresión de CD3 en PBMCs CAR+, sin cambios significativos en la frecuencia de células CD3⁺, acompañado de una mayor mortalidad basal asociada al proceso de transfección. En ensayos de co-cultivo, los PBMCs CAR+ no indujeron citotoxicidad significativa frente a células HEK293 (αvβ6⁻), mientras que mostraron una citotoxicidad específica y significativa frente a líneas tumorales αvβ6⁺, particularmente en la línea A549, alcanzando niveles de lisis del 40–60%.
En conjunto, los resultados sugieren que el CAR diseñado media una respuesta citotóxica antígenodependiente, respaldando su potencial aplicación terapéutica en tumores sólidos que sobreexpresan la integrina αvβ6. (Texto tomado de la fuente)
Abstract
This study aimed to design and functionally characterize a chimeric antigen receptor (CAR) targeting integrin αvβ6, integrating in silico and in vitro approaches.
Two antigen-recognition modified domains incorporating the PUI peptide were initially designed, a scFv and a sybody. Computational analyses demonstrated that the modified scFv retained structural stability and exhibited high theoretical affinity for αvβ6. The sybody showed experimental nanomolar affinity (KD ≈ 1.53 × 10⁻⁷ M) with favorable binding kinetics as determined by surface plasmon resonance, leading to its selection as the antigen-binding domain of the second-generation CAR DUI-28ζ, incorporating CD28 and CD3ζ intracellular signaling domains.
The CAR was transiently expressed in unpurified human PBMCs, achieving efficient transfection confirmed by fluorescence microscopy and statistical analysis (p < 0.001). Flow cytometry revealed increased CD3 fluorescence intensity in CAR+ PBMCs without significant changes in CD3⁺ cell frequency, along with increased basal cell death associated with the transfection process. In coculture assays, CAR+ PBMCs did not induce significant cytotoxicity against αvβ6-negative HEK293 cells, supporting antigen specificity. In contrast, robust and antigen-dependent cytotoxicity was observed against αvβ6-positive tumor cell lines, particularly A549, with lysis levels reaching 40–60%.
Overall, these findings demonstrate that the designed CAR mediates specific, antigen-dependent cytotoxicity, supporting its therapeutic potential for targeting αvβ6-overexpressing solid tumors.
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ilustraciones a color, diagramas