Transcripción de genes relacionados con la biosíntesis de sulfolípido y poliaciltrehalosas en mycobacterium tuberculosis y detección de su estado metabólico bajo condiciones experimentales de latencia

Abstract

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es el patógeno de origen bacteriano que causa el mayor número de muertes en el mundo. Según reportes de la Organización Mundial de la Salud (OMS), aproximadamente un tercio de la población mundial, se encuentra infectada con Mtb, una situación que se complica por la multirresistencia a los compuestos antituberculosos. Mtb puede sobrevivir en los individuos infectados por décadas sin causar manifestaciones clínicas en un estado conocido como tuberculosis (TB) latente, produciéndose TB activa en aproximadamente un 10% de los individuos infectados en algún momento de su vida. La OMS considera la TB, junto con el SIDA y la malaria como “enfermedades ligadas a la pobreza”. El diseño de compuestos antituberculosos requiere el conocimiento de los mecanismos que permiten la sobrevivencia del bacilo latente, caracterizado por enfrentar situaciones de estrés como bajo nivel de oxígeno (hipoxia) y de nutrientes (inanición). El bacilo tuberculoso en estado latente es capaz de sobrevivir en los fagosomas de células dendríticas, monocitos y macrófagos alveolares, utilizando diferentes vías para evadir la respuesta inmune. La inhibición de la maduración del fagosoma, la resistencia a mecanismos microbicidas y la evasión de las defensas mediadas por citocinas son algunos ejemplos de cómo Mtb logra su supervivencia. En estado latente, Mtb modifica la estructura general de la envoltura celular impidiendo su detección por microscopía convencional y por tinción Ziehl-­‐Nielsen. Estudios preliminares en nuestro grupo de investigación muestran que existe una disminución de la fijación del colorante rojo neutro (RN) en Mtb crecidas bajo condiciones de hipoxia in vitro, lo que sugiere una variación en la virulencia. Igualmente hemos observado que glicolípidos como sulfolípido (SL) y diaciltrehalosas (DAT) se presentan en cantidades diferenciales cuando las micobacterias son cultivadas bajo condiciones de hipoxia, lo que nos induce a pensar que en latencia existe una alteración de la virulencia y posible alteración de la respuesta inmune mediada por glicolípidos de envoltura. Este hecho se puede relacionar con la influencia del regulador transcripcional PhoP (considerado también como factor de virulencia) que regula la respuesta al estrés celular de Mtb y la biosíntesis de diversos componentes lipídicos presentes en la pared micobacteriana. Hasta el momento no se ha reportado el efecto de la hipoxia en la regulación de los genes involucrados en la biosíntesis de los glicolípidos SL y DAT/poliaciltrehalosas (PAT), un mecanismo que podría ser relevante para la supervivencia del bacilo en las condiciones hostiles del macrófago. Actualmente existen diversos modelos in vitro para estudiar cambios fisiológicos de las micobacterias en estado latente, entre ellos se encuentra el reportado por Wayne y Hayes en el que se produce un agotamiento gradual de oxígeno en el medio de cultivo, donde las bacterias entran en un estado persistente no replicativo (NRP) simulando el ambiente del bacilo tuberculoso dentro del granuloma. Por otro lado, los modelos de inanición permiten detectar cambios metabólicos en micobacterias que carecen de nutrientes para su crecimiento y diseminación. Es claro que en estos modelos, el bacilo tuberculoso entra en un estado de dormancia, en el que solamente se llevan a cabo funciones metabólicas relevantes para lograr supervivencia de la bacteria. Estos cambios pueden ser monitoreados con el uso de técnicas electroquímicas de alta sensibilidad, lo que permite considerar la hipoxia e inanición como modelos experimentales pertinentes en el estudio de latencia en micobacterias. En el presente trabajo se utilizaron micobacterias cultivadas en condiciones de hipoxia y anaerobiosis, para determinar el nivel de transcripción de genes involucrados en la biosíntesis de SL y DAT/PAT. El estado metabólico real de las bacterias utilizadas se determino mediante medidas electroquímicas, lo que igualmente se corroboro mediante determinación de algunas características bioquímicas de las células. Especificamente, se estimo de forma indirecta el cambio de metabolismo generado por la hipoxia y la inanición en Mtb H37Ra, M. bovis BCG y M. smegmatis mc2155, midiendo por medio cronoamperometria y cronopotenciometria el intercambio electrónico entre la micobacteria y el mediador electroquímico 2,6 --‐ diclorofenol indofenol (DCIP). De esta forma, se pudo concluir la utilidad de cepas de micobacterias no patogénicas y de rápido crecimiento para la caracterización de la dormancia. Tambien se determinaron variaciones importantes en la actividad ureasa, catalasa y nitrato reductasa de las micobacterias crecidas en condiciones de hipoxia e inanicion, corroborando y analizando características del estado latente. De manera simultanea se utilizo qRT--‐PCR para comparar los niveles de transcripción de los genes que codifican para aciltranferasas papA1 (SL), papA2 (SL) y papA3 (PAT), policetidosintasas pks2 (SL) y pks3/4 (PAT), los traslocadores mmpL8 (SL)Y mmpL10 (PAT) involucrados en la biosíntesis de SL y DAT/PAT y del regulador transcripcional pop de Mtb H37Rv, a partir de bacterias cultivadas en aireación y en condiciones experimentales de hipoxia: bacilos en estado persistente no replicativo (NRP1) y anaerobiosis (NRP2). Se encontro que existe una alta tasa de transcripción de los genes pks cuando se llega a anaerobiosis y una fuerte represión de los traslocadores lo cual explica las variaciones fenotípicas encontradas para SL y DAT en hipoxia, detectadas previamente en nuestro grupo de investigación.