Análisis fenotípico y funcional de Fast-DCs con propósitos de inmunoterapia

Abstract

Por su eficiencia en el procesamiento y presentación del antígeno, las células dendríticas (DCs) han venido siendo utilizadas ampliamente en numerosos ensayos clínicos de inmunoterapia en pacientes con cáncer. En estos estudios se ha comprobado la eficacia de las DCs como células profesionales presentadoras del antígeno capaces de procesar y presentar diferentes formas de antígeno al sistema inmune con capacidad de inducir de manera efectiva Linfocitos T Citotóxicos (CTLs) antitumorales en diferentes tipos de tumores cuando son utilizadas como vehículo del antígeno en vacunas terapéuticas contra el cáncer. Hasta el momento, las DCs han venido siendo derivadas a partir de monocitos de sangre periférica luego de su cultivo en Factor Estimulador de Colonias de Macrófago y Granulocito (GM-CSF) e Interleuquina 4 (IL-4) por 5 días y maduradas por diferentes tipos de estímulo, por 48 horas adicionales (Estándar-DCs). No obstante la eficiente generación de DCs con fines de inmunoterapia lograda hasta ahora mediante este procedimiento, la producción de este tipo de DCs se considera altamente laboriosa y de alto costo, por lo cual modificaciones al proceso de producción que redunden en una obtención más rápida es altamente deseable. Evidencias recientes por otros grupos sugieren que monocitos cultivados en GM-CSF e IL-4 por 24 horas y madurados con un coctel de citoquinas pro-inflamatorias por 24 horas adicionales conduce a la obtención de DCs rápidas (Fast-DCs). Aunque las Fast-DCs podrían ser deseables para ser usadas como vehículo del antígeno en inmunoterapia de cáncer, su uso en este campo está aún por ser demostrado. En este trabajo se realizó la caracterización fenotípica de DCs derivadas de monocitos de sangre periférica (Fast-DCs y Estándar-DCs) mediante los métodos de purificación por adherencia y por rosetas en individuos sanos de la población colombiana. Se analizó la expresión de marcadores de diferenciación de DCs y moléculas co-estimuladoras (CD14, CD80, CD83, CD209, CD86, HLA-DR); expresión del receptor CCR7 para las quimoquinas CCL19/CCL21 en respuesta a un coctel de maduración: Interleuquina 6 (IL-6), Interleuquina 1 Beta (IL-1β), Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α) y Prostaglandina E2 (PGE-2). Para evaluar la inmunogenicidad de las Fast-DCs a Antígenos Asociados a Tumor restringidos a HLA-A*0201 (TAAs-A2) como Melan-A, NY-ESO1, Her-2/neu y Telomerasa, LT CD8+ de individuos normales HLA-A*0201 positivos, purificados mediante perlas magnéticas, fueron co-cultivados durante 10 días en presencia de Interleuquina 2 (IL-2) e Interleuquina 7 (IL-7) y re-estimulados por 2 días con Fast-DCs pulsadas con péptido. La determinación de citotoxicidad (CD107a y CD107b) y de linfocitos T (LT) CD8+ específicos para los TAAs-A2 empleados, se realizó por citometría de flujo (CF). Además, fue evaluada la función de Fast-DCs como Células Presentadoras de Antígeno (APCs) en una Reacción Mixta de Linfocitos (MLR), y determinada la proliferación de LT CD4 alogenéicos y la producción de IFN-γ en sobrenadantes de cultivo por Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Mientras fue evidenciada una sobre-expresión de CD80, CD83 y CCR7 y una disminución en la expresión de CD209 en Fast-DCs y Estándar-DCs en respuesta al estímulo de maduración, no se encontraron diferencias importantes a nivel fisiológico en la expresión de CD86 y HLA-DR. La expresión de CD14 fue mayor en Fast-DCs comparado con la expresión en Estándar-DCs. Se observaron poblaciones de LT CD8+ específicos de péptido Melan-A y NY-ESO1 (tetrámero positivas) luego de haber sido estimulados por Fast-DCs pulsadas con el péptido correspondiente. Asimismo, células CD8+ estimuladas con Fast-DCs tuvieron capacidad citotóxica sobre células blanco, evidenciada por la expresión CD107a y CD107b determinada por CF. Fast-DCs pulsadas con toxoide tetánico (TT) fueron eficientes en generar una respuesta linfoproliferativa de LT CD4+ productores de IFN-γ en respuesta a un estímulo no específico (Fitohemaglutinina – PHA) y en respuesta a un antígeno definido (TT). Además, Fast-DCs indujeron la proliferación de LT CD4+ heterólogos, productores de IFN-γ en una MLR. A pesar de que la vacunación con DCs pulsadas con TAAs-A2 ha sido cuidadosamente evaluada en individuos Caucásicos como alternativa para la inmunoterapia en cáncer, la cobertura e inmunogenicidad de este tipo de vacunas en la población colombiana está aún por establecerse. En este contexto, la reducción de costos en la generación de Fast-DCs y la inmunogenicidad probada de Fast-DCs maduras, pulsadas con TAAs-A2, conduce a predecir que estas células pueden ser una importante alternativa para la inmunoterapia del cáncer en Colombia.