Detección y cuantificación de spongospora subterranea f. sp. subterranea y su virus asociado potato mop top virus (pmtv) en cultivos de papa de colombia, mediante pcr en tiempo real

Abstract

El cultivo de papa es uno de los renglones agrícolas de mayor importancia en Colombia. Desde el punto vista fitosanitario, la papa en los últimos años ha sido afectada por la re-emergencia de la Sarna polvosa y de su virus asociado Potato mop top virus (PMTV). La Sarna polvosa es causada por el plasmodiofórido Spongospora subterranea f.sp. subterranea (Sss) y se caracteriza por afectar el sistema radicular de las plantas y la calidad de los tubérculos. Aunque Sss es un patógeno obligado, puede permanecer latente en los suelos en forma de estructuras de resistencia (quistosoros), lo cual dificulta su control. En Colombia, han sido varios los métodos que se han utilizado para la detección de Sss y PMTV en plantas y tejidos asintomáticos, incluyendo bioensayos con plantas señuelo, PCR y RT-PCR y pruebas ELISA. Sin embargo, estos métodos generalmente requieren periodos prolongados de tiempo, son de baja sensibilidad o no permiten la cuantificación de los niveles de inóculo de estos patógenos. Una alternativa para complementar dichas herramientas es la PCR y RT-PCR en tiempo real (qPCR y qRT-PCR) para Sss y PMTV, respectivamente. En este trabajo se evaluaron técnicas de tiempo real, utilizando pares de cebadores previamente reportados en la literatura y adicionalmente se diseñó un par de cebadores con base en secuencias de aislamientos colombianos de Sss. Para el caso de Sss, los cebadores SsTQF1-SsTQR1; Spon421F-Spon494R y SscolF-SscolR (este estudio), fueron evaluados bajo la metodología de SYBR Green®, con el sistema Taqman® se evaluaron los cebadores SponF y SponR y la sonda SponP. Se descartó el par Spon421F-Spon494R en las pruebas de funcionalidad de cebadores, y con los cebadores restantes se realizaron curvas estándar basadas en diluciones seriadas de quistosoros. Las pruebas de qPCR permitieron detectar a Sss en 20 muestras de plantas señuelo de Nicotiana benthamiana y papa, utilizando los cebadores SsTQF1-SsTQR1 (Ct: 10,57-29,34) y SscolF-SscolR (Ct: 14,39-34,08); mientras que 19 de las muestras fueron detectadas con SponF-SponR-SponP (Ct: 15,63-38,93). De igual forma, a partir de 20 muestras de raíces obtenidas de cultivos de papa de La Unión (Antioquia), fue posible detectar a Sss en 17 muestras con los cebadores SscolF-SscolR, estimándose una concentración de 6.470 a 1,39x1010 quistorosos/mL. Para PMTV, se realizó la prueba de qRT-PCR en dos pasos con los cebadores PMTV-1948F/PMTV-2017R y la sonda Taqman® PMTV-1970, dirigidos al gen CP-RT del ARN2 viral. La curva estándar se construyó a partir de la transcripción in vitro de un fragmento de 1513 pb de este gen, realizándose diluciones seriadas de 1000ng/μL (1,20x1018 partículas virales/μL) a 0,1 ng/μL (1,20x108 partículas virales/μL). Posteriormente, se evaluó la utilidad de la técnica a partir de tres tipos de muestras: plantas señuelo de Nicotiana benthamiana y Solanum phureja inoculadas con quistosoros de Sss, raíces de papa con síntomas de Sarna polvosa obtenidas directamente de cultivos del municipio de la Unión (Antioquia) y tubérculos-semilla comercializados en este municipio. Los resultados muestran que mediante qRT-PCR fue posible detectar el virus en 11 de las 20 muestras de raíz de plantas señuelo, mientras que 14 de las 15 muestras de papa obtenidas en el campo resultaron positivas para este virus, estimándose una concentración entre 4,72x1011 partículas virales/µL y 7,60x1013 partículas virales/µL. Finalmente, en el ensayo de tubérculo-semilla se determinó la presencia del PMTV en una de las 16 muestras evaluadas. Estos resultados indican la ocurrencia de altos niveles de inóculo de Sss en los cultivos de papa de esta zona y enfatizan en la necesidad de fortalecer los programas de certificación de tubérculo-semilla y vigilancia cuarentenaria de Sss y PMTV en las diferentes regiones de Colombia. Finalmente, en el estudio se evaluó la presencia de regiones microsatélites a partir de la pirosecuenciación parcial del genoma de Sss, diseñándose diez pares de cebadores para su amplificación. Igualmente, se diseñaron cebadores específicos con base en secuencias del ADN mitocondrial (ADNmit), para su utilización como una herramienta adicional de detección y análisis de variabilidad genética de Sss. Luego de evaluar su especificidad y secuencias, se seleccionaron cinco marcadores microsatélites, tres de los cuales resultaron polimórficos entre cepas representantes de los tres tipos de Sss en Colombia. Así mismo, tres pares de cebadores específicos dirigidos a las regiones intergénicas del ADNmit, fueron seleccionados para amplificar regiones variables entre aislamientos de Sss.