Evaluación de los niveles de expresión “in vitro” de enzimas pectinolíticas del hongo Colletotrichum acutatum en presencia de inductores naturales provenientes del fruto de lulo (Solanum quitoense Lam). Avances para determinar sus niveles de transcripción

Abstract

Con el fin de aportar a la caracterización de los eventos bioquímicos que median la interacción del fruto de lulo (Solanum quitoense Lam) con el patógeno Colletotricum acutatum, causante de la enfermedad conocida como antracnosis, se evaluó “in vitro” la secreción por parte del hongo de las enzimas pectinolíticas, poligalacturonasa y pectato liasa en presencia de exocarpo o pared celular del fruto en diferentes estados de maduración (verde, pintón y maduro). Las condiciones seleccionadas para la determinación de la actividad de la enzima poligalacturonasa en extractos enzimáticos crudos fueron: ácido poligalacturónico 0,3% empleado como sustrato, 60 μL de extracto enzimático, pH 5.0, 37°C y un tiempo de incubación de 90 minutos; para la enzima pectato liasa fueron: ácido poligalacturónico 0,3% empleado como sustrato, 150 μL de extracto enzimático, pH 8,5, CaCl2 0,5 mM, 45°C y un tiempo de incubación de 60 minutos. El estado de maduración del fruto más relevante en esta interacción hospedero-patógeno, es el pintón, ya que generó la inducción de las dos enzimas, mientras que la presencia de inductores en estado verde produjo disminución de la actividad enzimática; estos hechos podrían sugerir mayor labilidad del fruto en estado pintón y menor en estado verde. En cuanto al efecto generado por la presencia de pared celular o exocarpo del fruto, se encontró menor inducción enzimática con la pared celular. Las mayores diferencias entre los 2 inductores se presentaron con la enzima pectato liasa. Los resultados muestran que la enzima poligalacturonasa secretada por el hongo Colletotrichum acutatum es constitutiva y la pectato liasa es una enzima inducible por los tres estados de maduración de los inductores empleados. En cuanto a los avances en los estudios transcripcionales, se seleccionó un método de extracción de RNA empleando el reactivo comercial Tri reagent® y se obtuvo un plásmido que contiene un fragmento del gen pel, para ser empleado en estudios de RT-qPCR. / Abstract. In order to contribute to the characterization of the biochemical events that mediate the interaction of Lulo fruit (Solanum quitoense Lam) with the pathogen Colletotricum acutatum which causes the antracnosis disease, the fungus secretion of pectinolythic polygalacturonase and pectato lyase enzymes was evaluated in vitro in the presence of fruit cell wall or exocarp in different maturity stages (unripe, semi-ripe and ripe). The better conditions for the determination of the activity of polygalacturonase enzyme in crude enzymatic extracts were: polygalacturonic acid 0.3% used as substrate, 60 μL of enzymatic extract, pH 5.0, 37°C and an incubation time of 90 minutes; In turn for the pectate lyase enzyme were: polygalacturonic acid 0.3% used as substrate, 150 μL of enzymatic extract, pH 8.5, CaCl2 0.5 mM, 45°C and an incubation time of 60 minutes. The more relevant maturity stage in the host-pathogen interaction is the semi-ripe stage because it generates the induction of the two enzymes while the presence of inductors in unripe stage produced the decrease in the enzymatic activity; these facts could suggest the more unsteadily of the fruit in the semi-ripe stage and less unsteadily in unripe stage. With respect to the effect generated by the presence of fruit cell wall or exocarp, a less induction enzymatic was found with cell wall/exocarp. The greater differences between the two inductors were presented with the pectato lyase enzyme. The results show that the polygalacturonase enzyme secreted by the fungus Colletotrichum acutatum is constitutive and pectate lyase is an inducible enzyme by the three stages of maturity of the used inductors. Regarding the advances in the transcriptional studies it was selected a RNA extraction method using the commercial reactive Tri reagent® and a plasmid was obtained which contains a fragment of gene pel to be used in RT-qPCR studies.