Aislamiento y caracterización de cepas nativas del Herpesvirus Bovino-1 (BHV-1) para la generación de un biológico vacunal inactivado y/o recombinante

Abstract

El BHV-1, es un virus de genoma ADN perteneciente a la Familia Herpesviridae y a la subfamilia Alfaherpesvinae y posee múltiples cepas serológicamente indiferenciables. Con base en el análisis genómico se ha clasificado en tres subtipos: BHV-1.1, BHV-1.2a, BHV-1.2b.Es un agente de distribución global causante de graves pérdidas económicas. En nuestro país, ha sido reportado desde comienzos de los años 70 y aunque existe un plan de vacunación y prevención de la enfermedad, se sospecha que es uno de los principales limitantes de las explotaciones ganaderas del país. El objetivo del presente trabajo de tesis fue realizar un estudio sero-epidemiológico que permitiera aislar y posteriormente caracterizar cepas del BHV-1 presentes en hatos ganaderos de diferentes regiones de Colombia, para generar, a partir de éstas, un biológico vacunal inactivado y/o recombinante y realizar una evaluación inicial de su eficiencia como inmunógeno para las condiciones del país. Utilizando la prueba de seroneutralización en cultivo celular, se encontró un 100% de prevalencia serológica por hato para el BHV-1 y una prevalencia general por individuos del 75.63%. Posteriormente, mediante inmunosupresión farmacológica, se realizó aislamiento viral en individuos que presentaron los títulos seroneutralizantes más altos, lográndose aislamientos del virus tanto de toros como de vacas y de diferentes muestras, indicándose un estado de enzootia de la infección. Se lograron 18 aislamientos realizados en 5 zonas del país (Córdoba, Llanos, Bogotá, Antioquia y Valle del Cauca). Todos los virus fueron confirmados por PCR y titulados por Dosis Infecciosa y Unidades formadoras de placa, para posteriormente caracterizar la virulencia in vitro de los mismos mediante curvas de crecimiento en monocapas y sobrenadantes, evaluación del fenotipo de placa y análisis el ADN viral con enzimas de restricción y de las glicoproteínas virales mediante western blot. Se encontró que algunas cepas tuvieron un comportamiento altamente virulento in vitro con periodos de eclipse más cortos, más rápida liberación de virus al sobrenadante, mayor tamaño de placa y mayor título viral. No se encontraron diferencias entre la expresión de glicoproteínas. La mayoría de los virus fueron confirmados como BHV-1.1 y sólo uno de ellos como BHV-1.2a. Indicándose con estos resultados que algunas cepas nativas del BHV-1 podrían ser útiles como semilla para el desarrollo de nuevas vacunas. Utilizando la cepa Córdoba 2, la cual se caracterizó como altamente virulenta, se desarrolló una vacuna inactivada con etilenimina binaria y se evaluó su potencial en un modelo de conejo. Los resultados permiten evidenciar que el uso de nuestra cepa nativa como semilla vacunal, permite el desarrollo de una fuerte inmunidad neutralizante con mejor protección ante el reto con virus de referencia aun comparándolo con vacunas comerciales disminuyendo la presentación de fiebre y la excreción viral. Finalmente se presenta el desarrollo técnico de un poxvirus recombinante que expresa la glicoproteína D del BHV-1 como un modelo alternativo para inducir una eficiente respuesta inmune. / Abstract: BHV-1 is a DNA virus belonging to the Herpesviridae family and Alfaherpesvinae subfamily that has multiple strains serologically indistinguishable between them. Based on genomic analysis has been classified in two types and three subtypes BHV-1.1, BHV- 1.2a, BHV-1.2b. It has a worldwide distribution causing serious economic losses. In our country, has been reported since early 70's and although there are vaccination and prevention programs, it is suspected as a major constraint of livestock in the country. The aim of this thesis was to conduct a sero-epidemiological study to isolate and subsequently characterize BHV-1 strains found in cattle herds from different regions of Colombia, to generate, from these, one inactivated and / or recombinant vaccine and perform an initial evaluation of its efficiency as immunogen for the country. Using the serum neutralization test in cell culture, we found prevalence by herd of 100% and an overall prevalence of 75.63% by individuals. Subsequently, using pharmacologic immunosuppression, viral isolation was performed in individuals with higher seroneutralizing titers, isolating virus as from bulls as cows and from different samples, indicating an enzootic behavior of the infection. We obtained a total of 18 isolates from 5 areas of the country (Córdoba, Llanos, Bogotá, Antioquia and Valle del Cauca), all viruses were confirmed by PCR and titrated by infectious dose and by plaque-forming units, and later to characterize the virulence in vitro, one step growth curves were performed in monolayers and supernatants, we evaluated plaque phenotype and we analyzed viral DNA with restriction enzymes and the viral glycoproteins by Western blot analysis to characterize molecularly the viral isolations. It was found that some strains were highly virulent in vitro with shorter eclipse periods, faster release of virus into the supernatant, larger plaque and higher viral titer. No differences were found between the expressions of glycoproteins. Most of the viruses were confirmed as BHV-1.1 and only one as BHV-1.2a. These results indicating that some native strains of BHV-1 could be useful as a seed for the development of new vaccines. Using Córdoba 2 strain, which was characterized as highly virulent, we developed a binary ethyleneimine inactivated vaccine and evaluated their potential in a rabbit model. The results pointed to the use of our native strain as seed, allowing the development of a strong neutralizing immunity with better protection against virus challenge compared to commercial vaccine, decreasing the presentation of fever and viral excretion. Finally we present the technical development of a recombinant poxvirus expressing the glycoprotein D of BHV-1 as an alternative model to induce an efficient immune response.