Evaluación de la disminución de la expresión de Pink1 en eventos de fusión y fisión mitocondrial en un modelo de neuronas dopaminérgicas

Abstract

Las mitocondrias están muy lejos de ser organelos estáticos. Actualmente está bien establecido que las mitocondrias están sometidas a un proceso constante de cambio, al cual se le ha denominado dinámica mitocondrial que incluye procesos de fusión y fisión. Hay muchas evidencias acerca de que la pérdida de función de Pink1 y de la dinámica mitocondrial son responsables de diferentes enfermedades neurodegenerativas, incluyendo el Parkinson tipo 2. En este trabajo se estudió el efecto del silenciamiento de Pink1 eventos de fusión y fisión mitocondrial en neuronas dopaminérgicas. La disminución de la expresión de Pink1 se realizó usando plásmidos lentivirales con dos secuencias de shRNA y mediante qPCR se comprobó que los niveles de Pink1 disminuyeron en más del 80%. Se hicieron ensayos de MTT para evaluar actividad mitocondrial, mientras que las proteínas de fusión fisión fueron analizadas mediante western blot y la morfología mitocondrial con microscopía confocal. Las células transducidas con el constructo shPink1 muestran una disminución en actividad mitocondrial y menores niveles de expresión de Drp1 y de Mfn2, en un 31 y 55%, respectivamente. Sus mitocondrias tienen una morfología principalmente fragmentada y también se encontró que estas células no responden de la misma manera que las células control ante el estímulo generado por la forskolina, un potenciador de la vía del cAMP que fosforila a Drp1, inactivándolo. De esta manera se propone que Pink1 puede ejercer un papel neuroprotector promoviendo fusión mitocondrial.

Abstract. Mitochondria are organelles far from being static. It is now well established that mitochondria are subject to a constant process of change, which has been called mitochondrial dynamics, including fusion and fission processes. There are a lot of evidences that show that the loss of function of Pink1 and mitochondrial dynamics are responsible for various neurodegenerative diseases, including Parkinson type 2. In this work, we studied the effect of silencing Pink1 in events of mitochondrial fusion and fission, in dopaminergic neurons. Two lentiviral shRNA sequences were used to knockdown Pink1 and by qPCR it was found that Pink1 levels decreased more than 80%. MTT assays were conducted to assess mitochondrial activity, while fission-fusion proteins were analyzed by western blot and mitochondrial morphology by confocal microscopy. The cells transduced with the construct against Pink1 show a decrease in mitochondrial activity and reduced levels of expression of Drp1 and Mfn2, by 31 and 55%, respectively. Their mitochondrial morphology was mainly fragmented and we also found that these cells do not respond the same way that the control ones to the stimulus generated by forskolin, an enhancer of cAMP pathway that phosphorylates Drp1, inactivating it. Thus it is proposed that Pink1 can exert a neuroprotective role by promoting mitochondrial fusion.