Obtención de un anticuerpo contra la proteína p65 del virus de la tristeza de los cítricos y resultados preliminares de la expresión in vivo

Abstract

El virus de la tristeza de los cítricos (CTV) pertenece a la familia Closteroviridae que incluye a los únicos virus vegetales que poseen en su genoma genes homólogos a las proteínas de choque térmico celulares HSP70. Recien­temente se ha demostrado que las proteínas virales HSP70h, como la p65 de CTV, realizan funciones para el ensam­blaje del virión, como proteína de unión a microtúbulos y de movimiento célula a célula. De allí la importancia de desarrollar trabajos relacionados con esta proteína en el CTV, considerado el patógeno más deletéreo para los cítricos. En el presente estudio, fueron utilizados cuatro péptidos sintéticos correspondientes a la región carboxi-terminal de la proteína de choque térmico p65 del virus de la tristeza de los cítricos (CTV), para inmunizar conejos con el objetivo de obtener anticuerpos policlonales. Todos los péptidos utilizados fueron inmunogénicos. Ninguno de los anticuerpos obtenidos reaccionó contra el extracto de plantas no infectadas pero sí detectaron las proteínas p65 presentes en los extractos proteicos de cítricos infectados con el CTV. Se demostró un comportamiento inmunológico del anticuerpo anti p65 que parece ser independiente de la severidad sintomática del aislado de CTV utilizado, sobre la base de la exposición del anticuerpo a dos aislados colombianos con características serológicas diferentes. Se demostró que el ORF que codifica en el CTV para el homólogo de la HSP70 se expresa in vivo aunque el anticuerpo anti p65 solamente detectó extractos proteicos concentrados de plantas infectadas, lo que apoya lo informado en otros estudios sobre la baja concentración de esta proteína en plantas infectadas con el CTV. Es la primera vez que se obtiene en Colombia un anticuerpo policlonal anti CTV y, particularmente, contra p65, proteína que interviene en el ensamblaje y movimiento viral. La adaptación de una técnica de obtención de anticuerpos anti p65 a través de la utilización de péptidos sintéticos como inmunógenos podría ser útil en un futuro para la detec­ción o diagnóstico de proteínas p65 presentes en diversos aislados colombianos de CTV y, especialmente, para desarrollar estudios que aporten mayor comprensión sobre la biología viral, su control y la relación con el huésped.

The citric tristeza virus (CTV) belongs to the Closteroviridae family which indudes the only vegetal viruses possessing genes homologous to HSP70 thermal cellular shock proteins in their genome. Such is the case of the gene encoding for the CTV p65 protein which presents high homology with the HSP70 protein family. It has been shown recently that HSP70h viral proteins (such as CTV p65) are involved both in viral assembly, as a microtubule binding protein, and in cell-cell movement. Since CTV is the most deleterious citrus pathogen, understanding this protein's role in the pathogenesis process is important. Rabbits were immunised with four synthetic peptides (corresponding to CTV p65 thermal shock protein's carboxyl-terminal region) to obtain polyclonal antibodies. All the peptides used were immunogenic, even though two of them showed greater response. Whilst none of the antibodies obtained reacted to non-infected plant extract, the p65 proteins was detected in extracts taken from citric plants infected with CTV Based on the antibody's reaction to two Colombian isolates having different serological characteristics, the p65 antibody's immunological behaviour appeared to be independent of the symptomatic severity of the CTV isolates. It was shown that the ORF encoded for the HSP70 homologue in CTV was expressed in vivo, even though the p65 antibody was only detected in concentrated protein extracts taken from infected plants, supporting reports from other studies that the concentration of this protein in plants infected with CTV is low. This is the first time that a polyclonal CTV antibody has been obtained in Colombia against p65 (a protein intervening in viral assembly and movement). Adapting a technique for obtaining p65 antibodies by using synthetic peptides as immunogens could be useful in the future for detecting or diagnosing p65 proteins present in different Colombian CTV isolates, especially in developing studies contributing towards greater understanding of viral biology, their control and relationship with the host.