Evaluación transitoria del promotor del gen de la proteina de la capside del virus del mosaico amarillo de la papa (pymv) - Colombia en plantas de tabaco

Abstract

Los promotores derivados de virus son herramientas biotecnológicas muy útiles que permiten regular la expresión de genes de interés en plantas transgénicas. Sin embargo algunos promotores no promueven eficientemente la transcripción de genes en diferentes plantas, siendo necesario evaluar nuevos promotores que permitan obtener mejores resultados en cuanto a expresión y estabilidad génica. Con base en lo anterior, el presente estudio tuvo como objetivo general: Evaluar la expresión transitoria del promotor del gen de la proteína de la cápside del Virus del mosaico amarrillo de la papaColombia (PYMV-Col) en plantas de Nicotiana tabacum var Xanthicultivadas in vitro. Para cumplir este objetivo, se optimizaron las condiciones de biobalística, utilizando el promotor 35S de CaMV fusionado al gen uidA, clonado en el vector pBI121. Las condiciones evaluadas fueron: presión de disparo, número de disparos, distancia de disparo y reactivo para eliminar pigmentos en fragmentos de hojas u hojas completas de tabaco. Las condiciones optimizadas fueron validadas utilizando el vector pCAMBIA 1305,2. Posteriormente se generó unvector de expresión heteróloga (PYMV-CPGUS) constituido por el promotor del gen de CP de PYMV-Col, fusionado al gen uidA y mediante ensayos transitorios se evaluóla expresión del gen uidAbajo la acción del promotor CP-PYMV de acuerdo al número de puntos azules obtenidos y el tejido donde fueron encontradoscon base a la expresión génica obtenida con el promotor 35S de CaMV.Las condiciones óptimas de biobalística fueron: una presión de 160psi, 4 disparos, 0 cm de distancia y etanol 70% sobre hojas completas de tabaco. Estas condiciones fueron validadas con pCAMBIA 1305,2 con el cual se obtuvo un alto número de puntos azules en los tejidos vegetales evaluados. El promedio del número de puntos azules obtenidos con el promotor CP-PYMV-Col fusionado al gen uidA (GUS) fue 23.2 en una hoja de N. tabacum y el promedio del número de puntos obtenidos con el promotor 35S de CaMV fue 26.6. Respecto a la expresión del promotor CP-PYMV-Col fue observada específicamente en células del mesófilo.

//Abstract: The promoters derivates of virus are very useful biotechnological tools to regulate the expression of genes of interest in transgenic plants. However, some promoters do not promote transcription efficiently of genes in different plants, being necessary to evaluate new promoters to obtain better results in terms of gene expression and stability. Based on the above, the present study aims: to evaluate the transient expression of the coat protein promoter of the Potato yellow mosaic virus- Colombia (PYMV-Col) in Nicotiana tabacum var Xanthi plants in vitro cultivated. To carry out this objective, the biolistic conditions were optimized using the 35S CaMV promoter fused to the uidA gene. The evaluated conditions were: pressure shot, number of shots, shooting distance and reagent to remove pigments in fragments of leaves or whole leaves tobacco. The optimizated conditions were validated using pCAMBIA 1305.2 vector. Subsequently, a heterologous expression vector (PYMV-CPGUS) was generated, constituted by the CP promoter of PYMV-Col, fused to the uidA gene and through transient assays was evaluated uidA gene under the action of CP-PYMV promoter according to the number of blue points obtained and the tissue where they were found based on gene expression obtained with the 35S CaMV promoter. Optimum conditions for biolistic were pressure 160psi, 4 shots, 0 cm of distance and ethanol 70% on whole leaves of tobacco. These conditions were validated with pCAMBIA 1305.2 and were obtained a high number of blue spots in plant tissues evaluated. The average number of blue spots obtained with the CP-PYMV-Col promoter fused to the uidA (GUS) gene was 23.2 on a leaf of N. tabacum and the average number of points obtained with the 35S CaMV promoter was 26.6 and expression of CP-PYMV-Col promoter was specifically observed in mesophyll cells.