Construcción de una genoteca de cdna de fríjol (phaseolus vulgaris l.) para mapeo genético

Abstract

Se construyó una pequeña librería de cDNA de fríjol (phaseolus vulgaris L.) de alrededor de 1500 clones, con el fin de incrementar la saturación del mapa de ligamiento de fríjol con marcadores de RFLPs. Para la generación de la librería se utilizó la técnica de amplificación por PCR (Jepson et al., 1991). En ella se utilizan como iniciadores para la reacción los mismos adaptadores empleados para generar los terminales cohesivos del cDNA. Se obtuvieron insertos con un promedio de 500 pares de bases. Se aislaron 93 clones, los cuales mostraron un porcentaje de repetición del 61 %. De los clones con patrón único, el 80% fueron de copia única y el 20% fueron de bajo número de copias. Se evaluó el polimorfismo de tres pares de parentales de frijol, escogidos por sus características agronómicas. El polimorfismo total más alto se halló con la enzima de restricción EcoRI (77%), luego le siguieron Dral (73%), EcoRI (63%) y Hindlll (60%). El par más polimórfico fue DOR60 con APN18, con 71% para EcoRV y 57% para EcoRI respectivamente. Se analizaron por hibridización dos clones de los grupos con más repeticiones en "slot blot" contra los demás clones y DNA que codifica para yRNA, con el fin de aclarar el origen de las repeticiones. Sólo uno de ellos parece ser de origen ribosomal, como lo sugiere el patrón de hibridización con DNA genómico de fríjol digerido con HaeIII, lo cual puede indicar que el grupo al cual pertenece es probablemente de origen ribosomal. Esto se puede explicar probablemente por la combinación en la metodología de amplificación por PCR con la utilización de iniciadores múltiples para la síntesis de la primera cadena de cDNA.

A small cDNA library from beans (Phaseolus vulgaris L.) of about 1500 clones was constructed, to further saturate the bean RFLP linkage map. The primarily synthesized cDNAs were amplified by PCR using the adaptors as primers for amplification (Jepson et al., 1991). Inserts in the range of 500 bp were obtained. 93 clones were singled for further analysis. They showed a degree of repeatibility of around 61 %. Around 80% of the unique clones were single copy, and 20% were low copy sequences as expected from a cDNA library. Three pairs of parental bean lines were chosen for their agronomical traits, and evaluated for polymorphism, which was highest as revealed by digestion with EcoRV (77%), followed by DraI (73%), EcoRI (63%) and HindIIl (60%). The highest polymorphism was observed between the pair DOR60 and APNI8, 71% for EcoRV and 57% for EcoRI, respectively. Two clones of the two groups with the most repeated clones were analyzed by slot blot hybridization against the other clones and ribosomal DNA, to understand the origin of the repetitions. Only one clone seemed to be of ribosomal origin, as confirmed by the patterns obtained by hybridization to bean genomic DNA digested with HaelIl, implying that the whole group to which it belonged was of ribosomal origin. It can be explained by the combined utilization of the PCR amplification methodology and the multipleprimers for the synthesis of the first cDNA strand.