Aislamiento y cultivo de protoplastos en maracuyá

Abstract

En este trabajo se ajustaron las condiciones para la regeneración de plántulas a partir del cultivo de protoplastos, proceso indispensable para avanzar hacia la obtención de híbridos somáticos. Se realizó el aislamiento de protoplastos a partir de cotiledones y hojas de plántulas in vitro de Passiflora edulis var. flavicarpa; estos explantes fueron sumergidos en solución CPW13M para inducir plasmólisis. Posteriormente se ensayaron tres combinaciones enzimáticas, los mayores rendimientos fueron 6,48 x 106 y 4,60 x 106 protoplastos viables /500 mg de tejido, obtenidos respectivamente con lacombinación de Celulasa R-10 al 1% y Pectolyasa Y-23 al 0,05% a partir de hojas y la solución enzimática Celulasa al 2% y Macerozima al 0,4% para cotiledones. Las mejores densidades de cultivo para los protoplastos fueron 5 x 104 protoplastos/ml para los obtenidos de cotiledones y 1,5 x 105 protoplastos/ml para los aislados de hojas, empleando el sistema de cultivo en gotas de medio KM8p solidificadas con agarosa al 0,6% y recubiertas con medio líquido KM8p con 100 g/l de glucosa y cefotaxim 300 μg/ml. Con las primeras divisiones celulares, se empezó a disminuir el nivel osmótico al renovar el medio líquido con la mezcla de medio KM8p:KM8 en proporción 3:1 y se continuó cada siete días en proporciones 2:1, 1:1 y 1:3 hasta la obtención de colonias y callos. Los callos fueron transferidos a medio MS con 2 mg/l de BAP y 1 mg/l de AIB para inducir la regeneración en condiciones de iluminación; después de seis semanas de cultivo se diferenciaron yemas, posteriormente fueron subcultivadas a medio MS sin reguladores de crecimiento para su enraizamiento.

In this research we adjust the protoplasts culture and regeneration conditions, necessary to advance into somatic hybrids obtention. Isolation of Passiflora edulis var. flavicarpa protoplasts from in vitro seedlings cotyledons and leaves was carried out. These tissues were plasmolysed in a CPW13M solution, then exposed to enzymatic solutions. The better yields were 6,48 x 106 and 4,60 x 106 protoplasts/500 mg of tissue, reached with the mixture Cellulase R-10 1% and Pectolyase Y-23 0,05% from leaves, and the enzymatic solution Cellulase 2% and Macerozyme 0,4% from cotyledons tissue, respectively. The best densities for protoplasts culture were 5 x 104 protoplasts/ml obtained from cotyledons and 1,5 x 105 protoplast/ml from leaves, employing agarose droplets system, bathing by KM8p liquid media with glucose 100g/l and cefotaxime 300μg/ml. When first cell divisions occurred, the osmotic concentration was reduced by removing the liquid media and adding equal volume of fresh mix media KM8p:KM8 in a ratio of 3:1. Every seven days, this action was repited using mix media in ratios of 2:1, 1:1, and 1:3, until colonies and callus formation was achieved. Then, the call were transferred into MS media with BAP 2 mg/l and IBA 1 mg/l for plant regeneration on light conditions. After six weeks shoot differentiation was promoved, finally those shoots were subcultured to free regulators media for rooting.