Síntesis de constructos de multicopias peptídicas de secuencias derivadas de la proteína apical sushi protein (asp) de plasmodium falciparum: caracterización fisicoquímica y estudios de inmunogenicidad

Abstract

La malaria continúa siendo uno de los problemas de salud pública de mayor relevancia a nivel mundial. En la actualidad más del 40% de la población mundial que habita en las regiones tropicales y subtropicales son endémicas de esta enfermedad. Pese a las estrategias propuestas por entidades como la OMS y OPS, en el último año se registraron 216 millones de casos clínicos de malaria y cerca de 655.000 decesos por esta causa, mayoritariamente mujeres embarazadas y niños menores de cinco años de edad. Este problema se ha visto ostensiblemente agravado por múltiples circunstancias, entre estas los fuertes cambios climáticos de los últimos años que han permitido la colonización de nuevos territorios anteriormente carentes de malaria, la resistencia por parte del Plasmodium (agente causal de la enfermedad) a los diferentes esquemas de antibióticos empleados para su control y así mismo la resistencia de la hembra del mosquito Anopheles (vector de transmisión de la enfermedad) a los insecticidas más usados. Por lo anterior la búsqueda de nuevas estrategias tanto terapéuticas como inmunoprofilácticas sigue siendo una prioridad global. En la actualidad alrededor de 150 diferentes prototipos de vacuna contra la malaria se encuentran en diferentes fases de investigación sin resultados alentadores respecto a la prevención de la enfermedad. Sin embargo un esfuerzo importante realizado en los años ochenta, liderado por el Profesor Manuel Elkin Patarroyo y su equipo condujo a la obtención de la primera vacuna sintética contra esta enfermedad denominada SPf66, cuya eficacia protectora contra la enfermedad fue en promedio entre 30 a 50% en los diferentes estudios clínicos realizados en diferentes lugares del mundo. Desde entonces, este equipo de investigación ha venido ahondando en el estudio de los complejos mecanismos de infección empleados por el Plasmodium falciparum (especie de malaria letal al humano) para el desarrollo de una nueva generación de vacuna sintética multiestadío, multiantigénica y definida fisicoquímicamente como unidades macromoleculares. Como parte importante de este engranaje, hemos planteado en este trabajo la obtención de constructos macromoleculares sintéticos totalmente definidos. Para ello nos basamos en el diseño racional de inmunógenos modificados estratégicamente, provenientes de regiones no polimórficas de antígenos relevantes del Plasmodium que evidencien motivos o sitios clave para su unión a las células blanco del patógeno en estadios sanguíneos, en este caso al glóbulo rojo. Este tipo de modificaciones a nivel de estructura primaria de los antígenos nativos incluye la detección de posibles marcos de lectura por parte del HLA. Teniendo en cuenta lo anterior, seleccionamos un antígeno expresado en los organelos apicales de los estadios merozoito y esquizonte maduro del parasito denominado Apical Sushi Protein (PfASP), denominado así por poseer dominios tipo Sushi caracterizados por contener puentes disulfuro semejantes a los encontrados en moléculas de la cascada del complemento del sistema inmunológico humano. Una vez determinados cuatro péptidos con alta capacidad de unión a glóbulos rojos (denominados HABPs por High Activity Binding Peptides) codificados como 34259, 34270, 34273 y 34290 ubicados en diferentes lugares dentro de la estructura de 731 aminoácidos de PfASP, estos se sintetizaron como polímeros no controlados vía Cisteínas y se sometieron a evaluación de diferentes propiedades biológicas, entre ellas su capacidad citotóxica, hemolítica, antigénica y además fueron evaluados funcionalmente por su capacidad de evidenciar control de la infección por malaria en un modelo animal experimental de roedores previamente vacunados con estos polímeros y sus análogos modificados estratégicamente, esto teniendo en cuenta la alta semejanza estructural entre la proteína humana PfASP y secuencias ortólogas en Plasmodium berghei y Plasmodium yoelii. Con las secuencias de PfASP que evidenciaron perfiles de actividad funcional más relevantes, se decidió diseñar y elaborar constructos macromoleculares definidos tetraméricamente empleando varias estrategias para su posterior análisis, entre estas la síntesis de polímeros no controlados vía Cisteínas, constructos lineales obtenidos por condensación de bloque, dobles dímeros convencionales o asimétricos y finalmente dobles dímeros simétricos en los cuales se funcionalizaron residuos de lisina en el núcleo de propagación de este nuevo tipo de dendrímeros con el propósito de equiparar tanto las distancias como la reactividad de las funciones amino primaria respecto al carbono alpha. A algunos de los constructos se incorporaron secuencias blanco sustrato de Catepsinas (enzimas presentes a nivel lisosomal en las células profesionales fagocíticas APC) con el propósito de tratar de guiar la presentación antigénica de estos análogos sintéticos. Estos compuestos se obtuvieron con rendimientos diferenciales en cantidades suficientes para los ensayos de actividad funcional. Con esta batería de análogos sintéticos se realizaron nuevamente estudios de actividad citotóxica, hemolítica, antigénica e inmunogénica en ensayos de protección en grupos de animales experimentales, ratones BALB/c. Se encontró que algunos de estos constructos, como son los Dobles Dímeros Simétricos y Constructos Lineales por Condensación que contenían las secuencias blanco de Catepsinas y otros espaciadores como ácido aminohexanóico, evidenciaron controlar de manera eficiente los niveles de infección en los animales desafiados con las dos cepas de malaria murina. Los linfocitos B presentes en el bazo de aquellos animales que evidenciaron controlar la infección por malaria se sometieron a análisis del perfil de citoquinas secretadas y se encontró que en algunos casos la respuesta fue coherente con perfiles definidos Th2, otros Th1 preferencialmente y algunos una relación equiparable Th1-Th2, indicando la capacidad inmuno-estimuladora de este tipo de compuestos definidos fisicoquímicamente y evidenciando su papel en el campo de nuevas vacunas contra la malaria diseñadas racionalmente.

Abstract. Malaria is still one of the most important public health problems worldwide. Currently, over 40% of the world population living in tropical and subtropical regions is endemic for this disease. In spite of all strategies proposed by organizations such as WHO —World Health Organization— and PAHO —Panamerican Health Organization—, for the last year 216 million clinical cases of malaria were registered and nearly 655,000 deaths due to this cause, mainly pregnant women and children under five years of edge. This problem has been visibly worsened by multiple circumstances among them, the strong climate changes over recent years, which have allowed the colonization of new territories where malaria was not present before, resistant evolved mechanisms by Plasmodium species —the causative agent of this disease— to antibiotics and that of the female Anopheles mosquito (the malaria transmission vector) to insecticides such as DDT. Therefore, the search for new therapeutic and immunoprophylactic strategies for this deathly disease remains a global priority. Currently, about 150 different prototypes of malaria vaccines are at different stages of research without promising results regarding the prevention of the disease. However, a significant effort in the eighties, headed by Professor Manuel Elkin Patarroyo and his team, led the development of the first synthetic vaccine called SPf66 against this disease, whose protective efficacy was averaged between 30-50% in different clinical trials conducted in different parts of the world. Since then, this research team has been delving into the study of the complex infection mechanisms used by Plasmodium falciparum —lethal species for human beings— as the basis for developing a new generation of a multistage and multiantigenic and completely physicochemically defined vaccine presented as a macromolecular unit. As an important part of this gear, we have proposed obtaining of fully defined synthetic macromolecular constructs. In order to do this, we rely on the rational design of strategically modified immunogens. Such immunogens belong to non-polymorphic regions of the Plasmodium’s blood states relevant antigens characterized by harbouring high binding motifs to the pathogen’s target cells. Such site-directed mutations at the native antigens primary structure level have considered potential HLA reading frames. Taking the above considerations into account, we have selected a specific antigen expressed on the apical organelles of the merozoite as well as in mature schizont stages of the parasite known as Apical Sushi Protein (PfASP), because of their Sushi domains which are characterized by disulfide bridges similar to those found in the complement cascade molecules of the human immunological system. Having identified four High Activity Binding Peptides (HABPs), they were coded as 34259, 34270, 34273 and 34290 respectively and all of them are located at different places in the 731 aminoacids of the PfASP. These were synthesized as uncontrolled polymers via cysteine reactivity and were subjected to the evaluation of different biological properties, including their cytotoxic, hemolytic and antigenic activity. Besides, they were functionally evaluated to determine if they were able to control the malaria infection in an experimental animal model, in which mice were previously immunized with these polymers and their strategically modified analogues, considering the high structural similarity between the human PfASP and its orthologous sequences in the Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii. Upon detection of those PfASP sequences that showed profiles with most relevant functional activity, it was decided to design and develop tetramerically defined macromolecular constructs by using several strategies for further analysis, among these uncontrolled polymer synthesis via cysteine reactivity, linear constructs obtained by blocks condensation, conventional or asymmetric double dimers and finally symmetrical double dimers in which lysine residues were functionalized at the spreading nucleus of this new type of dendrimers, in order to equalize both distances and reactivity of these two primary amino functions in relation to the alpha carbon. Cathepsins substrate target sequences —enzymes present at a lysosomal level in the antigen-presenting cells— were incorporated onto some constructs primary structure in order to guide the antigen presentation of these synthetic analogues by APC— antigen presenting cells. These compounds were obtained in differential overall yields in sufficient amounts to conduct the functional activity trials. With this set of synthetic analogues, cytotoxic, hemolytic, antigenic and immunologic activity studies were conducted in protection trials in experimental animal groups of BALB/c mice. Some of these constructs, such as Symmetric Double Dimers and Linear Condensed Constructs which contained the target sequences of Cathepsins and other spacers such as aminohexanoic acid, were found to control efficiently the infection levels in animals exposed to the two strains of rodent malaria. B cells present in the spleen cells of those animals which were able to control the malaria infection were subjected to an analysis of secreted cytokines. The results show that, in some cases, the response was consistent with Th2 profiles, other Th1 preferentially and others having an equivalent Th1-Th2 ratio which indicates the immuno-stimulatory capacity of this novel type of physicochemically defined compounds revealing thus their role in rationally designed new malaria vaccines