Caracterización de la unión específica a macrófagos de péptidos derivados de lipoproteínas de Mycobacterium tuberculosis y análisis de la respuesta inmune

Abstract

La tuberculosis sigue siendo una de las enfermedades infecciosas de mayor incidencia en salud pública a nivel mundial. Se ha considerado que un tercio de la población mundial se encuentra infectada con el bacilo causante de la tuberculosis pulmonar (Mycobacterium tuberculosis) aunque solo 5 a 10% de la personas infectadas desarrollan la enfermedad. El proceso infeccioso se inicia en las vías respiratorias, siendo los principales blancos las células epiteliales y los macrófagos localizados en los alvéolos pulmonares, este proceso requiere de la interacción patógeno – hospedero. Se han estudiado los eventos que permiten al bacilo evadir la respuesta inmune y la activación apropiada de los macrófagos una vez son infectados y se ha establecido la importancia de la respuesta inmune celular en el control de la enfermedad. En este trabajo se presenta el diseño metodológico que permite la identificación de secuencias derivadas de proteínas de superficie de Mycobacterium tuberculosis H37Rv que podrían estar involucradas en la interacción patógeno hospedero. El análisis in silico del genoma de esta micobacteria permitió la identificación de lipoproteínas que potencialmente podrían localizarse en la superficie de la bacteria. Posteriormente se verificó la presencia de los genes que codifican para las proteínas de interés y su expresión en la cepa de laboratorio, M. tuberculosis H37Rv, bajo condiciones normales de cultivo. A continuación se identificaron las secuencias peptídicas de dichas proteínas que se unían específicamente y con alta afinidad a células blanco de infección y que podrían estar involucradas en su reconocimiento. Como parte de la caracterización funcional de estas secuencias de alta capacidad de unión específica se determinó, en ensayos in vitro, su capacidad de inhibir la entrada de la micobacteria a células blanco de infección así como su capacidad para promueven la internalización de microesferas cubiertas con los péptidos a células no fagocíticas A549. Además se estableció la capacidad de los pooles de péptidos de cada una de las lipoproteínas para inducir una respuesta de linfoproliferación y se determinó el perfil de citocinas secretadas. Finalmente se determinó la capacidad de mismos pooles de péptidos para inhibir el crecimiento intracelular de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, efecto que podría asociarse con el potencial protectivo que pueden presentar los péptidos de las proteínas de interés en el modelo murino. El desarrollo del presente trabajo se fundamenta en los promisorios resultados obtenidos en la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia -FIDIC-, donde se han podido establecer las pautas que permiten el diseño racional de una vacuna subunitaria, multiantigénica, basada en péptidos sintéticos, efectiva contra enfermedades infecciosas como la malaria. A pesar de las diferencias entre estos patógenos, aquí se presentan los resultados aplicando la misma metodología, ahora en la selección de antígenos que potencialmente pudieran ser la base de una vacuna eficiente contra tuberculosis

Abstract. Tuberculosis continues being one of the infectious diseases having the greatest incidence regarding worldwide public health. It has been considered that a third of the world’s population are infected with the bacillus causing pulmonary tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis), even though just 5% to 10% of the infected people develop the full-blown disease. Infection begins in the respiratory tract, epithelial cells and alveolar macrophages located in the pulmonary alveoli being the main target; this requires a pathogen–host interaction. The events allowing the bacilli to evade the immune response have been studied, as have the appropriate activation of the macrophages once they have become infected whilst the importance of a cellular immune response in controlling the disease has also been established. This work presents the methodological design which led to the identification of sequences derived from Mycobacterium tuberculosis H37Rv surface proteins involved in the pathogen-host interaction. In silico analysis of this mycobacterium’s genome facilitated the selection of lipoproteins which might possibly formed part of its surface. The presence of genes encoding proteins of interest were then determined, as well as their expression in the M. tuberculosis H37Rv laboratory strain in normal culture conditions. Such proteins’ peptide sequences binding specifically and with high affinity to target cells for the infection were then identified as they could have been involved in its recognition. Part of the functional characterisation of these high specific binding capacity sequences was determined, in in vitro assays, if they inhibited mycobacteria entry to target cells of infection and whether such sequences promoted the internalisation of peptide-covered microspheres in non-phagocytic A549 cells. Their lymphoproliferation induction capacity and cytokine profile were also established, as well as their protective potential as Mycobacterium tuberculosis H37Rv intracellular growth inhibitors which could present peptides from proteins of interest in a murine model, in in vitro assays. The development of the present work was based on promising results obtained at the Fundación Instituto de Inmunología de Colombia (FIDIC) where guidelines have been established which have led to the rational design of a subunit, multi-antigen, synthetic peptide-based vaccine which would be effective against malaria. In spite of the differences between these pathogens, an attempt has been made to apply an appropriate methodology for selecting potential antigens to be included in an effective anti-tuberculosis vaccine.