Caracterización molecular y análisis evolutivo de receptores de células Natural Killer tipo lectina en primates neotropicales

Abstract

La mayoría de las especies de primates neotropicales en Colombia se encuentran amenazadas o en peligro de extinción, debido principalmente a la destrucción de su hábitat y al aumento de la morbi-mortalidad como consecuencia de enfermedades infecciosas y malignas. En la interfase entre el sistema inmune adaptativo y el innato de los mamíferos, las células Natural Killer (NK) juegan un papel fundamental en el reconocimiento y eliminación de células malignas e infectadas por virus. La función de las células NK está regulada por receptores activadores e inhibidores específicos para moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad clase I presentes en las células blanco. Los receptores de células NK se clasifican en dos familias estructurales, la familia de las inmunoglobulinas y la de las lectinas. En el presente trabajo se caracterizaron dos receptores de células NK tipo lectina específicos para MHC clase I: CD94 y NKG2D, en nueve especies de primates de Colombia. RNA total se extrajo a partir de sangre periférica y fue amplificado por retrotranscriptasa reversa (RT)-PCR con iniciadores específicos. Los productos de amplificación fueron clonados y al menos 10 clones por cada individuo se secuenciaron por el método de Sanger. Las secuencias obtenidas mostraron un alto grado de conservación con aquellas de humanos y otros primates. Análisis filogenéticos con estas secuencias produjeron árboles que reflejan la filogenia de las especies. A pesar de su conservación, los genes que codifican para estos dos receptores tienen la capacidad de generar niveles altos de variabilidad mediante mecanismos de procesamiento alternativo del RNA. Catorce isoformas de CD94 y seis de NKG2D se identificaron, algunas de ellas presentes en todas las especies estudiadas mientras que otras están restringidas a solo un grupo de especies. Las variantes comunes a varias especies han sido probablemente seleccionadas para llevar a cabo funciones distintas a la de la forma completa. El modelamiento por homología de las estructuras mostró que la mayoría de las variantes son incapaces de interactuar con las moléculas del MHC clase I en la célula blanco, pero conservan regiones que podrían interactuar con otros ligandos. Los resultados de este estudio indican que los receptores de células NK tipo lectina CD94 y NKG2D son altamente conservados para funciones de reconocimiento del MHC, pero muestran un alto grado de diversificación por mecanismos de procesamiento alternativo del ARN que probablemente amplían su rango de especificidades.

Abstract. Most species of New World primates in Colombia are threatened or endangered, mainly due to habitat destruction and increased morbidity and mortality from infectious and malignant diseases. At the interface between the adaptive and the innate immune system of mammals, Natural Killer (NK) cells play a critical role in the recognition and elimination of malignant and virally infected cells. The role of NK cells is regulated by activators and inhibitors receptors that are specific for molecules of the Major Histocompatibility Complex class I present in the target cells. NK cell receptors are classified into two structural families, the immunoglobulins and lectins classes. In this thesis in nine Colombian New World Primate species, the CD94 and NKG2D C type lectine receptors specific to MHC class I molecules were characterized. Total RNA was extracted from peripheral blood, it was amplyfied by reverse transcriptase (RT)-PCR using specific primers. The amplification products were cloned and at least 10 clones per individual were sequenced by the Sanger method. The gene sequences are highly conserved with humans and othe primates. Phylogenetic analysis with this results produced trees that reflect the species phylogeny. Although conservation, the genes coding for these two receptors are capable to produce high levels of variability by alternative splicing mechanisms. Fourteen isoforms of CD94 and six of NKG2D were identified, some of which are present in all species studied while others are restricted only one group of species. In several species common variants have probably been evolutionary selected to perform different functions of the complete protein. Homology modeling of structures showed that most of the variants are unable to interact with MHC class I molecules on the target cell, however, these retain regions that could be interact with other ligands. The results of this study indicate that CD94 and NKG2D NK lectine receptors are hihhly conserved for MHC recognition functions, but show a high degree of diversification led by alternative splicing mechanisms that probably expand their range of specificities.