Efecto de la Apolipoproteína E2, 3 y 4 sobre la autofagia y la sobrevivencia en la línea neuronal CAD

Abstract

La Apolipoproteína E transporta colesterol y otros lípidos en el plasma y en el sistema nervioso central. La ApoE se une a los receptores LDLR para de esta manera controlar la homeostasis de lípidos. Existen tres alelos que traducen a tres isoformas de la proteína: ApoE 2 ApoE 3 y ApoE4, de las cuales, la ApoE4 ha sido definida como un factor de riesgo de la Enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, el mecanismo molecular de esta susceptibilidad no se ha definido aún. El objetivo de este trabajo es estudiar el efecto de las isoformas de ApoE2, 3 y 4 sobre las vías de sobrevivencia y autofagia en la línea CAD y bajo un contexto neurotóxico. La primera parte de los experimentos se enfocó en conocer la respuesta de las ApoE en la línea celular CAD durante la diferenciación, para lo cual las células diferenciadas fueron incubadas durante 24 horas con las isoformas de las ApoE. En la segunda parte se observó la respuesta de las ApoE bajo un contexto neurotóxico, y para esto las células diferenciadas fueron incubadas con las ApoE2, 3 o 4, pasada una hora se adicionó ceramida y se dejó en incubación por 24 horas. Se realizaron ensayos de LDH y MTT. Para cuantificar la presencia de las proteínas se utilizó la técnica de Western blot e inmunofluorescencia para detectar autofagosomas. En el primer modelo se observó un aumento en el metabolismo mitocondrial para el experimento con ApoE4: la viabilidad celular se mantuvo similar a la del control. En el tratamiento con la isoforma 4 de ApoE se da una hiperactivación de las vías Akt, ERK y p38; hay una disminución de AMPK y una inhibición de la autofagia, a diferencia de las isoformas de ApoE 2 y 3, donde se observa la activación de la autofagia. Estos resultados sugieren que la isoforma de ApoE4 está generando posiblemente aumento de ROS, lo que promueve la activación de vías de estrés celular como p38 y ERK. Al inhibirse la autofagia en este tratamiento, se da la acumulación de todos estos daños y se da una sensibilización de las células a la muerte, lo cual se observa en el siguiente modelo estudiado. En el segundo modelo (neurotoxicidad), el tratamiento de ApoE4-­‐ceramida presentó disminución en la viabilidad celular, y los tratamientos con ApoE2-­‐ceramida y ApoE3-­‐ ceramida, no. El tratamiento de ApoE4-­‐ceramida muestra una disminución en la fosforilación de Akt y AMPK, en comparación con los controles y los tratamientos de ApoE2-­‐ceramida y ApoE3-­‐ceramida. La presencia de la proteína ERK fosforilada no varía de manera significativa en los tratamientos y p38 fosforilada; evidencia una mayor presencia en los tratamientos de ApoE2-­‐ceramida y ApoE3–ceramida que en ApoE4-­‐ ceramida. Finalmente, estos resultados sugieren que las vías de sobrevivencia, metabolismo y autofagia en el tratamiento de ApoE4–ceramida presentan una desregulación principalmente en la inhibición de la autofagia que lleva a la muerte celular. En cambio, el tratamiento de ApoE2 y ApoE3 protege a la célula del efecto del neurotóxico mediante la activación de la autofagia.

Abstract. Apolipoprotein E (ApoE) carries cholesterol and other lipids, within both, the plasma, and the central nervous system. It binds to APOE receptors in order to control lipid homeostasis. There are three ApoE alleles in humans (ApoE2, 3 y 4). Although ApoE4 has been defined as a risk factor in Alzheimer’s diseases, the molecular effects associated to ApoE4 have not been fully described. The main purpose of the research is to study the differential effects of APOE isoforms in the survival and autophagy pathways under a neurotoxic model context. The first part of the experiments was focused to find out the CAD line’s reaction to the ApoE isoforms during the differentiation. In order to achieve it, the differentiation cells were incubated during a 24 hours period with ApoE isoforms. The second part of the process showed the ApoE reaction in neurotoxic context. To obtain it, the differentiated cells were incubated with the ApoE 2, 3 and 4. After 1 hour of pre-­‐treatment with ApoE,ceramide was added for incubation process during 24 hours. Mitochondrial metabolism was measured by MTT assay and cell survivor by LDH assay. Equally, protein’s expression was evaluated by Western blot’s technique in order to quantify proteins presence and immunofluorescences, so to finally detect, autophagosomes. When differentiated CAD cells were treated with ApoE 4, the first model showed an increase in MTT assay. In what cell viability is concerned, it was fairly similar to the Control one. Now, the increase in MTT assay is associated with an increase in the phosphorylation level of AKT(Ser 473), ERK 1-­‐2 (Thr 202/Tyr 204) and p38 (Thr180/Tyr 182); AMPK decreased and the autophagy was inhibited in comparison to ApoE2 and 3, where autophagy was activated. These results suggest that the isoform ApoE 4 generated an increase in the ROS causing cellular stress pathways as p38 and ERK. The autophagy inhibition in this treatment allows accumulation damage and cell sensitization to cell death, showed in the next model studied. The ApoE 4 and ceramide treatment causes a cellular viability decrease and the ApoE 2 and 3, does not. In the same way, it decreases in the phosphorylation level of AKT and AMPK, compared to ApoE2-­‐ceramide and ApoE3-­‐ceramide treatments. The presences of the phosphorylation of ERK protein does not show a significant variation in the treatments; phosphorylation of p38 variation is mainly revealed in ApoE 2 and 3-­‐ ceramide treatments. Finally, these results suggest that ApoE4-­‐ceramide treatment raises metabolism, and cellular stress response associated to activation of the p38 pathway (maybe associated to an increase production of ROS). Inhibition of autophagy is associated to cellular death whereas ApoE 3 and ApoE 2-­‐ceramide treatment protects cells from the neurotoxic effect through autophagy’s activation.