Sobreexpresión del gen RXam1 en yuca en la variedad modelo cv 60444

Abstract

La yuca es un cultivo de vital importancia para el consumo humano, especialmente en países tropicales y subtropicales. Una de sus principales limitaciones es la bacteriosis vascular, causada por Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam). Hasta ahora no se ha identificado ningún gen de resistencia en yuca a ninguna de sus enfermedades. Sin embargo se cuenta con un gen candidato denominado RXam1, el cual codifica para una proteína LRR serina-treonina quinasa similar a la proteína Xa21 de arroz que confiere resistencia a Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). Este gen colocaliza con un QTL que explica el 13% de la resistencia a la cepa CIO136 de Xam. En este trabajo se emplearon dos estrategias complementarias para la validación funcional del gen. En el primer caso se llevo a cabo la generación de plantas transgénicas de la variedad susceptible 60444 que sobreexpresan el gen. Se lograron obtener 19 putativas líneas transgénicas de yuca que mostraron la presencia de la construcción tanto por PCR como por expresión del gen marcador gus, tres de éstas líneas (15, 16 y 18) sobreexpresan RXam1. Las plantas están en proceso de multiplicación para poder llevar a cabo la caracterización fenotípica. Adicionalmente se buscó llevar a cabo una validación empleando un sistema heterólogo de más fácil manipulación como el arroz. El gen de yuca RXam1 fue transferido mediante transformación genética estable a la variedad Nipponbare, la cual es susceptible a Xoo. De las plantas transgénicas obtenidas se logró llevar hasta semillas T2. Dos de estas líneas y su control fueron caracterizadas molecular y fenotípicamente. Se pudo observar una segregación del transgén en cada una de esas líneas, pero no se observó una correlación entre la presencia del transgén detectado por PCR con la respuesta fenotípica a la infección por Xoo. Finalmente se realizó una búsqueda in silico de posibles genes PR en yuca. Se seleccionaron 15 miembros de diferentes familias de PR para el diseño de cebadores. Se evaluó la expresión de 14 de estos posibles genes PR en dos variedades de yuca: SG107-35 y 60444 a diferentes tiempos post-inoculación. Los perfiles de expresión no permitieron identificar un gen que se indujera específicamente en respuesta a Xam. Los resultados obtenidos en este trabajo permitirán validar la función del gen RXam1 de yuca y ganar un mejor conocimiento de las bases moleculares de la yuca a la bacteriosis vascular. Esta información podrá ser utilizada a futuro en los programas de mejoramiento.

Abstract. Cassava is a very important crop for human consumption, mainly in tropical and subtropical countries. One of its main limitations is the cassava bacterial blight caused by Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam). Until this moment there have not been identified any suitable gene of resistance in cassava to any of its diseases. Nevertheless there is a candidate gene denominated RXam1, which encodes or a LRR serinethreonine kinase protein, similar to Xa21 kinase. This gene colocalizes with a QTL, which explains the 13% of the resistance to the CIO136 strain of Xam. In this work two complementary strategies were used to validate functionally the gene. In the first case, transgenic plants of the variety 60444 overexpressing the gene were generated. Nineteen putative transgenic lines showed the presence of the construct by PCR and expression of the GUS reporter gene. Three of these lines (15, 16 and 18) overexpress RXam1. The plants are in a propagation process to achieve the phenotypic characterization. Additionally, it was aimed to validate the system by the use of an easier handling model, as rice. The gene RXam1 of cassava was transferred by genetic stable transformation of the variety Nipponbare, susceptible to Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). The transgenic plants obtained were taken until T2 seed. Two of these lines and its control were characterized molecular and phenotypically. A segregation of the transgen was observed on each lines, but there was not correlation observed between the presence of the transgen detected by PCR with the phenotypical answer to the infection by Xoo. Finally a search of possible PRs genes of Cassava was made in silico. Fifteen members of different PRs families of were selected for the design of primers. The expression of 14 of these was evaluated in two varieties of cassava: SG107-35 y 60444, in different post inoculation times. The profiles of expression did not allow identifying a gene induced specifically responding to Xam. The results obtained in this work will allow to validate the function of the gene RXam1 of cassava and to gain a better knowledge of the molecular basis of the cassava against bacterial blight. This information can be used in future in the breeding programs.