Identificación de marcadores de muerte celular que produce rotavirus WTEW en líneas tumorales REH y U937

Abstract

ANTECEDENTES El cáncer es la principal causa de muerte en países industrializados y segunda causa de muerte en países en vía de desarrollo. El número de pacientes con cáncer diagnosticado entre los años 2004 y 2008 fue de 28.8 millones [1, 2]. En la actualidad se intentan desarrollar diferentes tratamientos que incluyen la viroterapia oncolítica, en la cual los virus pueden ser utilizados en su estado silvestre, ser modificados genéticamente, pueden ser diseñados para depender de vías de señalización o programas de transcripción que se activan en células tumorales. Otros son diseñados teniendo en cuenta el proceso de entrada del virus a la célula y son modificados para que utilicen receptores celulares que solo se expresan en células tumorales [3]. Este enfoque ofrece seguridad en cuanto es específico de tumor, pero a la vez es una limitante porque el virus es específico solamente para los tumores que tengan dicho receptor celular. En la actualidad no se ha diseñado un virus con capacidad de actuar en los diferentes tipos de tumor o en todas las células que hacen parte de un tumor, incluso en tratamientos combinados con radioterapia y quimioterapia, debido a que los tejidos y cada una de las células tumorales presentan procesos biológicos y bioquímicos complejos. Según las consideraciones de la “Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH)” es necesario primero caracterizar el virus oncolítico y para esto se requiere evaluar su selectividad, para lo cual necesita de ensayos de citotoxicidad in vitro y/o replicación en líneas celulares permisivas (tumorales) y en no permisivas (células normales). Rotavirus tiene la capacidad de infectar líneas celulares de cáncer como se ha demostrado en células Caco 2 [4] y células HT-29 [5] de adenocarcinoma colorrectal. En trabajos previos en el laboratorio de Biología Molecular de Virus de la Facultad de medicina de la Universidad Nacional, se encontró que al evaluar las células de la línea Sp2/0-Ag14de y U937 infectadas por rotavirus presentan permeabilidad de la membrana citoplasmática, se encuentran señales de inducción de muerte celular por apoptosis y disminuye el número de células durante el proceso infeccioso, sugiriendo que la infección viral trae como consecuencia primero apoptosis y luego lisis celular. Existen reportes de que la infección por el rotavirus induce muerte celular por apoptosis en las células intestinales humanas Caco-2 [6] y oncosis en células MA104 al inducir alteración en la integridad de la membrana citoplasmática, sin ocasionar fragmentación del DNA o formación de cuerpos apoptóticos [7]. Se ha reportado que la proteína rotaviral NSP1 suprime en las primeras 8 h.p.i. la muerte celular prematura por apoptosis, activando señales de supervivencia vía PI3K y después de esta h.p.i. la célula muere por apoptosis [8]. Igualmente, en trabajos previos de nuestro laboratorio se halló que las cepas de rotavirus seleccionadas en el laboratorio infectan y lisan la línea celular Sp40 Ag-14 (mieloma de ratón), U-937 (linfoma histiocitico), REH (leucemia linfocitica aguda), Kato III (carcinoma gástrico), J774 (sarcoma de células reticulares), MDA (adenocarcinoma de seno), PC3 (adenocarcinoma grado IV de próstata), sugiriendo que las cepas estudiadas son potenciales virus oncolíticos. Sin embargo, las señales de inducción de muerte celular por apoptosis encontradas en estas líneas tumorales analizadas, fue al cabo de 12 horas post-infección. Por lo cual hay evidencias preliminares que sugieren lisis celular por mecanismos apoptóticos, pero no se ha profundizado en determinar a cuanto tiempo de la infección se inician las señales de muerte, ni se han precisado los eventos bioquímicos característicos de muerte celular en líneas U937 y REH infectadas con rotavirus WTEW, ni la relación con la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO - ROS) y si estos efectos se modifican al aplicar antioxidantes en líneas U937 y REH infectadas con rotavirus WTEW. OBJETIVO: Determinar marcadores de muerte celular en líneas U937 y REH infectadas con rotavirus WTEW. MATERIALES Y MÉTODOS: Las líneas U937 y REH se infectaron con rotavirus WTEW con un MOI de 2, se analizó la presencia de antígenos rotavirales usando anticuerpos contra proteínas estructurales y no estructurales de rotavirus mediante inmunocitoquímica. Se evalúo la exposición de la fosfatifilserina, la fragmentación con tinciones de Hoescht e Ioduro de propidio y rupturas del DNA con las técnicas de TUNEL y PARP, pérdida de potencial de membrana mitocondrial con el marcador DiOC 6, la actividad metabólica utilizando ensayos de MTT y Resazurina, niveles de ROS con el DHE del kit Cellomics® Oxidative Stress I. La expresión de las proteínas celulares IKB, COX, NFKB, PPARγ, HSP90 y PDI por inmunofluorescencia. RESULTADOS: Encontramos que las líneas U937 y REH se infectaron con rotavirus. Se promovieron marcadores de muerte celular asociados con apoptosis como la exposición de fosfatidil serina a las 11 h.p.i., aumento de la fragmentación, rupturas del DNA, activación de mecanismos de reparación, disminución del potencial de membrana mitocondrial. Se identificó que la actividad metabólica no disminuye en las primeras h.p.i., y su disminución es dependiente del MOI con que son infectadas. Los niveles de ROS aumentan en células de la línea U937 cuando son infectadas y disminuyen en células pre-tratadas con N-acetilcisteina, Tiazonilediona, Rosiglitazona, Pioglitazona y Curcumina, en la línea REH los niveles disminuyen en células infectadas cuando son pre-tratadas con N-acetilcisteina y Tiazonilediona. Los niveles de infección disminuyen en células REH y U937 cuando son pretratadas con todos los medicamentos. Se encontró que en células REH la expresión de las proteínas celulares IKB, COX, NFKB, PPARγ, HSP90 y PDI no varían entre las células infectadas con rotavirus WTEW y las células infectadas y tratadas con NAC, mientras en células de la línea U937 se presenta disminución significativa en las proteínas IKB, NFκB fosforilado y COX II cuando las células son infectadas y tratadas con NAC. CONCLUSIÓN: La infección del rotavirus WTEW a las células REH y U937 induce marcadores de muerte celular característicos de apoptosis.

Abstract. BACKGROUND Cancer is the leading cause of death in industrialized countries and the second cause of death in developing countries. The number of patients with cancer diagnosed between 2004 and 2008 was 28.8 million [1, 2]. Nowadays, science is trying to develop several treatments including the oncolytic virus therapy, in which the virus can be used in its natural state, be genetically modified, be designed to depend on signaling pathways and transcriptional programmes that are activated in tumor cells. Other are designed taking into account the process of virus entry into cells and are modified to use only expressed on the tumour cell surface receptors [3]. This approach provides certainty as it is specific to tumor, but also is a limitation because the virus is specific only for tumors that have this cellular receptor. At present there has not been designed a virus capable of acting on the various types of tumor or in all cells which are part of a tumor, even in therapy combinated with radiation and chemotherapy, because tissue and each of the tumor cells have complex biochemical and biological processes. According to the considerations of the "Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH)" it is necessary to characterize the oncolytic virus and this requires assessment its selectivity, for which it needs testing in vitro cytotoxicity and / or replication in permissive (tumour) and nonpermissive (normal) cells lines. Rotavirus is able of infecting cancer cell lines as it has been demonstrated in Caco 2 cells [4] and HT-29 cells [5] of colorectal adenocarcinoma. In previous works in the laboratory Virus Molecular Biology from the National University of Colombia, it was found that when evaluating cells Sp2/0-Ag14 and U937 lines infected by rotavirus have permeability of the cytoplasmic membrane, there are signs of induction of apoptosis cell death and decreases the number of cells during the infectious process, suggesting that the viral infection results first in apoptosis, then cell lysis. There are reports that rotavirus infection induces apoptotic cell death in the human intestinal Caco-2 cells [6] and oncosis in MA104 cells to induce alteration in the citoplasmatic membrane integrity without DNA fragmentation and formation of apoptotic bodies [7]. It has been reported that rotavirus NSP1 protein supreesses for the first 8 hpi premature cell death by apoptosis by activating survival pathways PI3K and after this hpi the cell dies by apoptosis [8]. Also, in previous work from our laboratory was found to rotavirus strains selected in the laboratory infect and lyse the cell line SP40 Ag-14 (mouse myeloma), U-937 (histiocytic lymphoma), REH (acute lymphocytic leukemia) Kato III (gastric carcinoma), J774 (reticulum cell sarcoma), MDA (breast adenocarcinoma), PC3 (prostate adenocarcinoma grade IV), suggesting that the strains studied are potential oncolytic virus. However, the signals of cell death induction by apoptosis found in these tumor lines tested were found 12 hours post-infection. Therefore there is preliminary evidence suggesting cell lysis by apoptotic mechanisms, but has not been analyzed to determine how long the infection death signals are initiated or has clarified the characteristic biochemical events of cell death in lines U937 and REH infected with WTEW rotavirus or the connection with the production of reactive oxygen species (ROS) and if these purposes are modified by applying antioxidants in U937 and REH lines infected by WTEW rotavirus. OBJETIVO: Determinig markers of cell death in REH and U937 cell lines infected with WTEW rotavirus. MATERIALS AND METHODS: REH and U937 cell lines were infected with WTEW rotavirus with an MOI 2, the presence of rotaviral antigens was analyzed using antibodies against structural and nonstructural proteins of rotavirus by immunochemistry. Phosphatidylserine exposure was analized, DNA fragmentation with Hoescht and propidium iodide stains, DNA breaks with TUNEL and PARP techniques, loss of mitochondrial membrane potential with DiOC6 dye, the metabolic active using MTT and resazurin assays, ROS levels with DHE from kit Cellomics® Oxidative Stress I. Expressión of cellular proteins IKB, COX, NFKB, PPARγ, HSP90 y PDI by immunofluorescence. RESULTS: We found that REH y U937 cell lines were infected with rotavirus. Markers of cell death associated with apoptosis such as Phosphatidylserine exposure at 11 h.p.i., increased fragmentation and breaks of DNA, activation repair mechanisms, decreased mitochondrial membrane potential were induced. It was also found that the cellular metabolic activity not reduced in the first h.p.i. and its reduction is dependent of the MOI with which they are infected. ROS levels are increased in U937 cell line when infected and decrease when are treated with N-acetyl cysteine (NAC), thiazolidinedione, rosiglitazone, pioglitazone and curcumin, on the REH line cell levels decline in infected cells when they are treated with NAC and thiazolidinedione. Infection levels decreased in REH and U937 cell lines when are pre-treated with all medications. It was found that in REH cells the expression of cellular proteins IKB, COX, NFKB, PPARγ, HSP90 y PDI not vary between cells infected with WTEW rotavirus and the infected cells and treated with NAC, while on U937 cell line current significant decreased in IKB, NFκB phosphorylated and COX II when cells are infected and treated with NAC CONCLUSION: WTEW rotavirus infection of REH and U937 cell lines induces cell death markers characteristic of apoptosis.