Desarrollo y evaluación de un prototipo de formulación a base de una mezcla de levaduras contra Botrytis cinerea en rosas

Abstract

Las levaduras poseen mecanismos de acción contra B. cinerea: competencia por espacio y nutrientes, producción de metabolitos secundarios inhibitorios, producción de compuestos orgánicos volátiles, entre otros. Sin embargo, las levaduras requieren ser formuladas para su estabilización y actividad bio-controladora en función del tiempo. Las formulaciones han usado mono-inóculos de antagonistas como principio activo, no obstante, sus mezclas también han sido empleadas, pero relegadas a un segundo plano. En este trabajo se desarrolló un prototipo de formulación liofilizado, a base de mezclas de levaduras con capacidad antagónica contra Botrytis cinerea. Se usaron seis aislamientos de levaduras: LvGr20, LvSb29, LvGr3, LvGr26, LvGr1 y LvGr10, del cepario del Laboratorio de Microbiología Agrícola del IBUN, Bogotá D.C. La evaluación de sus actividades bio-controladoras se llevó a cabo mediante antagonismo in vitro, empleando la técnica del enfrentamiento dual e, in vivo, sobre pétalos de rosa (Rosa sp. variedad Vendela), donde también se estimó la dosis-respuesta a concentraciones celulares que oscilaron entre 105 y 108 UFC/mL de levadura. El efecto de la producción de VOCs en el desarrollo de la enfermedad sobre pétalos de rosa también fue evaluado. Una vez se determinó la compatibilidad entre los aislamientos seleccionados (LvGr20 y LvSb29), se evaluó in vivo el efecto de las proporciones en mezclas celulares entre estas dos levaduras y, se estudió, el efecto de las interacciones de sus mezclas (a concentraciones entre 106 -108 UFC/mL), para el desarrollo de una formulación con actividad bio-controladora de B. cinerea. Con lo anterior se desarrolló un prototipo de formulación con manitol y trehalosa al 1% y 5% m/v como excipientes de formulación, usando una mezcla con proporción 2:1 de LvGr20 con respecto a LvSb29 y, empleando la liofilización como estrategia de estabilización celular; la formulación se almacenó a 4°C durante sesenta días. Al cabo de este tiempo, se evaluó viabilidad y actividad antagónica de las formulaciones en co-inoculación con B. cinerea. Después de 60 días, la viabilidad del prototipo de formulación con trehalosa registró valores más altos que manitol, 18% y 14% respectivamente, sin embargo, el control de sólo leche produjo la misma viabilidad que trehalosa. A pesar que en todas las formulaciones no hubo control de la enfermedad en co-inoculación, se evidenció que todos los aislamientos presentaron al menos un mecanismo de acción. Adicionalmente, se notó que la liofilización afectó diferentemente la viabilidad celular de los aislamientos seleccionados, lo cual, además de potenciar la patogenicidad de B. cinerea con leche, no permitió evidenciar la expresión de los mecanismos de control de los aislamientos en un ambiente oligotrófico.

Abstract. The yeasts have action mechanisms against B. cinerea: competence for nutrients and space, production of inhibitory secondary metabolites, production of volatil organic compounds (VOCs), and others. However, the yeasts need to be formulated for their stabilization and biological activity in function of time. The formulations have used mono-inoculums of antagonistic yeasts as active principle, however, the antagonistic mix have been used too, but relegated them to a second place. This work did development a prototype of lyophilized formulation (freeze-drying), with antagonistic capacity of a yeasts mix against B. cinerea. Six isolates yeasts were employed: LvGr20, LvSb29, LvGr3, LvGr26, LvGr1 and LvGr10, from strain collection agricultural microbiology laboratory, IBUN, Bogotá D.C. The evaluation of their biocontrol activities was made by in vitro antagonism, using the dual culture technique and, in vivo, employing petals of rose (Rosa sp. var. Vendela), calculating the dose-response to cellular concentrations that ranged between 105 and 108 CFU/mL of yeast. The effect of the VOCs production during the development of disease using petals of rose was evaluated too. To determinate the compatibility between the two selected isolates (LvGr20 y LvSb29), the effect of the proportions on cellular mixes with two yeasts and the effect of the interactions in two mixes yeasts (106 -108 CFU/mL) were evaluated in vivo, for the development of a prototype of formulation with biocontrol activity against B. cinerea. With these results, the prototype was developed, using mannitol and trehalose 1% y 5% m/v like additives of a formulation, employing a mix with ratio 2:1 of LvGr20 in respect to LvSb29 and using lyophilization as cellular stabilization strategy; the formulations were storing to 4°C during sixty days. After this time the viability and antagonistic activity of the formulations in co-inoculation with B. cinerea were assessed. After 60 days, the formulation with trehalose was higher than mannitol formulation viability values, 18% and 14% respectively, however, the control milk produced the same viability than trehalose. Although in all formulations there was not disease biocontrol with co-inoculation, all isolates showed at least one action mechanism. In addition, the lyophilization affected differently the cellular viability of the selected isolates, it, furthermore of to potentiate the B. cinerea´s pathogenicity with not fat milk, didn´t permit to show the expression of the action mechanisms of the isolates in an oligotrophic environment.