Síntesis y estudio de la actividad antiandrogénica in vivo e in vitro de análogos novedosos del androstano

Abstract

La hiperplasia prostática benigna (HPB) y el cáncer de próstata (CP) representan problemas de salud pública en el entorno nacional y mundial, dada su elevada incidencia en los hombres de mediana a avanzada edad. La enzima 5α-Reductasa, en especial en su isoforma 2 (5αR2), tiene una importante función enzimática en la amplificación de la respuesta androgénica en el tejido prostático, ya que cataliza la reducción del andrógeno endógeno testosterona (T) en su metabolito 5α-Dihidrotestosterona (5α-DHT), más afín por el receptor de andrógenos (RA) y por lo tanto, más eficaz para desencadenar la respuesta androgénica. Se conoce que la actividad catalítica anormalmente elevada de ésta enzima y por consiguiente, los niveles excesivos de 5α-DHT producidos, están implicados en el desarrollo y progresión de patologías prostáticas, como la hiperplasia prostática benigna y el cáncer de próstata. Por lo tanto, las investigaciones se han enfocado al diseño racional de fármacos inhibidores de esta enzima o de antagonistas del receptor de andrógenos (RA), como blancos estratégicos para su tratamiento. Con la finalidad de contribuir al descubrimiento de nuevos inhibidores de la enzima 5αR2, en el presente trabajo, se llevó a cabo el diseño, síntesis y evaluación biológica in vitro e in vivo de cuatro análogos novedosos del androstano con un grupo N-ciclohexilcarboxamida sobre C17. Las moléculas, fueron diseñadas con base en requisitos estructurales para inhibir a la enzima, entre los que destacan como grupo farmacofórico diferentes grados de insaturación y conjugación (5-en; 4-en-3-ona y 4,6-dien-3-ona) en los anillos A y B del núcleo androstano, y como grupo auxofórico, una N-ciclohexilcarboxamida en C17. Los compuestos de interés, fueron sintetizados a partir del acetato de 16-deshidropregnenolona, que fue modificada químicamente para dar origen a los análogos novedosos: N-ciclohexil-3β-acetoxiandrostan-5,16-dien-17-carboxamida (5), N-ciclohexil-3β-hidroxiandrostan-5,16-dien-17-carboxamida (6), N-ciclohexil-3-oxoandrostan-4,6,16-trien-17-carboxamida (7) y N-ciclohexil-3-oxoandrostan-4,16-dien-17-carboxamida (8). Asimismo, se obtuvieron los intermediarios de síntesis: ácido 3β-hidroxiandrostan-5,16-dien-17-carboxílico (2) y ácido 3β-acetoxiandrostan-5,16-dien-17-carboxílico (3). Tanto los compuestos novedosos 5 a 8, como los intermediarios de síntesis 2 y 3, fueron caracterizados mediante técnicas espectroscópicas (UV, IR, RMN 1H, 13C), espectrométricas (EM-IE, APCI, EM-FAB) y de difracción de Rayos X en algunos casos. Por otro lado, como medida de su posible biodisponibilidad oral, tanto a los compuestos novedosos como a los intermediarios de síntesis se les calculó el logaritmo de su coeficiente de partición en el sistema n-octanol/agua (Log P). La actividad de los análogos novedosos e intermediarios de síntesis sobre la biosíntesis y acción de los andrógenos endógenos, se evaluó in vitro e in vivo. Los ensayos in vitro consistieron en determinar el efecto inhibitorio de los compuestos sobre la enzima 5αR2 de próstata humana, comparando su efecto con el del fármaco de uso en terapéutica para el tratamiento de HPB, finasterida (F). Los resultados se expresaron como la concentración de compuesto que disminuye la actividad catalítica de la enzima en un cincuenta por ciento (CI50). También, se determinó su afinidad para unirse al RA de próstata de rata mediante ensayos con ligandos radioactivos, en los cuales se cuantificó la capacidad de los análogos del androstano sintetizados (2 a 8) para desplazar del sitio de unión, al ligando radiactivo patrón 17α-metil-3H-mibolerona. Los resultados se expresaron como el porcentaje remanente de 17α-metil-3H-mibolerona unida al RA al aumentar la concentración de cada compuesto. Como blanco adicional de acción, se determinó el efecto inhibitorio de los análogos del androstano sobre la enzima 17β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (17β-HSD) humana, la cual es una enzima que contribuye al desarrollo de CP hormono-refractario por llevar a cabo la biosíntesis de T intra-tumoral a partir de Δ4-androstendiona. En este caso, los resultados también estuvieron expresados como CI50. El efecto in vivo de los análogos sintetizados sobre la biosíntesis y/o acción de andrógenos endógenos se determinó en hámsteres macho gonadectomizados, tratados concomitantemente con T y/o cada uno de los análogos sintetizados 2 a 8 empleando F como referencia. El punto final de este ensayo, consistió en comparar el efecto de los análogos novedosos sobre el índice de masa (peso del órgano/peso corporal) para la próstata y las vesículas seminales, con el provocado por la F. También, se comparó el efecto de éstos con el de F sobre el diámetro de la mancha del órgano del flanco en los hámsteres tratados, a partir del cual, se pudo inferir su efecto inhibitorio sobre la isoforma 1 de la enzima 5α-Reductasa. Se encontró que la introducción del sustituyente N-ciclohexilcarboxamida sobre C17 en el núcleo esteroidal androstano, resultó benéfico para la actividad inhibitoria in vitro de la 5αR2, dado que los compuestos que presentaron esta característica estructural fueron significativamente mejores inhibidores (CI50 0.169, 0.105 y 0.155 nM, para 6, 7 y 8, respectivamente) que los intermediarios de síntesis que no la presentaron (CI50 1100, 467 nM, para 2 y 3, respectivamente) e incluso que F (CI50 8.5 nM). Asimismo, se determinó que el aumento en el grado de insaturación y conjugación en los anillos A y B del núcleo esteroidal también resultaron benéficos para dicha actividad, encontrando como más activo al compuesto 7, el cual presentó el mayor grado de insaturación y conjugación en su estructura por presentar la entidad 4,6-dien-3-ona. Se encontró que los análogos novedosos N-ciclohexilcarboxamida 6 a 8 carecen de afinidad por el RA, dado que no lograron desplazar de manera significativa al ligando patrón 17α-metil-3H-mibolerona del sitio de unión. Por otro lado, y contrario a lo esperado, se encontró que los análogos sintetizados 2 a 7 estimulan la actividad catalítica de la enzima 17β-hidroxiesteroide deshidrogenasa, al causar un aumento en los niveles de T producida a partir de Δ4-androstendiona, cuando se encontraron presentes en el medio de reacción. Los hallazgos de la presente investigación permiten suponer que los análogos novedosos N-ciclohexilcarboxamida 6 a 8 modulan dos rutas androgénicas. Por un lado, producen un efecto anabólico leve debido a un incremento en la biosíntesis de T a partir de Δ4-androstendiona a través de la 17β-HSD y por otro, evitan los efectos androgénicos indeseables de la 5α-DHT sobre la próstata por ser inhibidores de la enzima 5αR2. Resultando en un mecanismo de acción benéfico para el tratamiento de la HPB porque permite restablecer la acción fisiológica de la T y al mismo tiempo reducir la proliferación celular intra-prostática activada por la 5α-DHT. Con relación al efecto in vivo de los análogos sintetizados 2 a 8 sobre la biosíntesis y acción de los andrógenos endógenos, se encontró que en comparación a la F, ninguno de ellos disminuyó de manera significativa el crecimiento del órgano del flanco en los hámsteres gonadectomizados, tratados concomitantemente con T. Por lo tanto, fueron inactivos como inhibidores de la isoforma 1 de la enzima 5α-Reductasa. Adicionalmente, dado que tampoco disminuyeron de manera significativa el índice de la próstata ni de las vesículas seminales de los animales tratados, se determinó que carecieron de efecto antiandrogénico in vivo. Los valores de LogP calculados tanto para los análogos novedosos finales 5 a 8 como para los intermediarios de síntesis 2 a 3, indicaron que estas moléculas poseen mayor afinidad por la fase lipídica que por la fase acuosa, evidenciando con ello su carácter lipofílico. Dado que estos valores fueron mayores que 1 y que los valores de energía libre de transferencia derivados del LogP calculado fueron negativos, se infiere que su paso a través de membranas biológicas está favorecido termodinámicamente y ocurre de manera espontánea mediante un mecanismo de difusión pasiva. Por lo cual, se presume que dichos compuestos no presentarían problemas de permeabilidad en el organismo. Sin embargo, debido a que los análogos novedosos 6 a 8 fueron inactivos in vivo pero activos in vitro sobre la enzima 5αR2, hace suponer que algún proceso farmacocinético muy posiblemente relacionado con su metabolismo está afectando su biodisponiblidad y por ende su actividad in vivo.

Abstract. Benign prostatic hyperplasia (BPH) and prostate cancer (PC) are public health problems due to their high incidence in mature men. 5α-Reductase enzyme, particularly in its form 2 (5αR2), plays an important role in the amplification of androgenic responses in prostatic tissues, since it catalyses the reduction of the endogenous androgen testosterone (T) into 5α-Dihidrotestosterone (5α-DHT), which in turn, has more affinity to bind the androgen receptor (AR) and therefore, to exert androgenic responses. It is known that uncontrolled activity of 5αR2 and consequently, excessive levels of produced 5α-DHT, are implicated in the maintenance and development of prostatic disorders such as BPH and PC. Therefore, the research has been focused to the rational design of inhibitors for this enzyme as well as of androgen receptor antagonists, as targets for the treatment of these illnesses. In order to contribute to the design of a new potential class of 5αR2 inhibitors, the design, synthesis and in vitro and in vivo biological evaluation of four novel androstane steroid analogs with N-cyclohexylcarboxamide moiety at C17, was carried out. The molecules were designed based on structural requirements to inhibit the enzyme, such as different degrees of unsaturation and conjugation (5-ene, 4-ene-3-one and 4,6-diene-3-one) on A and B rings of androstane skeleton, which was the pharmacophore group. In addition, a N-cyclohexylcarboxamide moiety at C17 was the auxophore. The compounds were synthesized from 16-Dehydropregnenolone acetate, which was chemically modified in order to obtain the new analogues: N-cyclohexyl-3β-acetoxyandrost-5,16-diene-17-carboxamide (5), N-cyclohexyl-3β-hidroxyandrost-5,16-diene-17-carboxamide (6), N-cyclohexyl-3-oxoandrost-4,6,16-triene-17-carboxamide (7) and N-cyclohexyl-3-oxoandrost-4,16-diene-17-carboxamide (8). In addition, the synthesis intermediates: 3β-hydroxiandrost-5,16-dien-17-carboxilic acid (2) and 3β-acetoxyandrost-5,16-dien-17-carboxilic acid (3) were also obtained. Both, new compounds (5 to 8) and intermediates (2 and 3) were characterized by spectroscopic (UV, IR, 1H, 13C NMR) and spectrometric techniques (MS-EI, APCI, FAB-MS) as well as by X rays in some instances. On the other hand, the logarithm of the partition coefficient in n-octanol/water system (Log P) of both, new compounds and intermediates was determined (Log P) as a measure of their possible oral bioavailability. The effect of both, novel androstane analogues 5 to 8 and synthesis intermediates 2 and 3 on the biosynthesis and action of endogenous androgens was evaluated by in vitro and in vivo assays. In the in vitro assays, their inhibitory effect on human 5αR2 enzyme was determined and compared with that of the drug control finasteride (F). The results were expressed as the concentration of each compound able to decrease the catalytic activity of the enzyme in fifty percent (IC50). Additionally, their affinity to bind to rat prostate AR was also determined by radioligand assays, quantifying the ability of each compound (2 to 8) to displace the control ligand 17α-methyl-3H-mibolerone from the binding site at AR. The results were expressed in terms of the percentage of remaining concentration of 17α-methyl-3H-mibolerone when the concentration of each compound was increased. Finally, their ability to inhibit the human enzyme 17β-hydroxysteroid dehydrogenase (17β-HSD) was also tested, as an additional target that contributes to the development of hormone-refractory PC, due to its ability to carry out the biosynthesis of T from Δ4-androstenedione into the tumor. In this case, the results were also expressed as IC50. The in vivo effect of the synthesized analogues on the biosynthesis and action of endogenous androgens was determined on castrated male hamsters treated concomitantly with T and/or compounds 2 to 8, using F as a control. The endpoint of this assay consisted in comparing the effect caused by the androstane analogues on mass indexes (weight organ/weight body) for prostate and seminal vesicles, with that of F. In addition, their effect on the diameter size of pigmented flank organs of hamsters was also determined and compared with F, as a measure of their inhibitory effect on the form 1 of 5α-Reductase. It was found, that the introduction of the N-cyclohexylcarboxamide moiety at C17 on the androstane skeleton was beneficial for the in vitro inhibitory effect of human 5αR2, since the novel analogues bearing this characteristic (IC50 0.169, 0.105 and 0.155 nM, for 6, 7 and 8, respectively) were more active than the synthesis intermediates which did not present it (IC50 1100, 467 nM, for 2 and 3, respectively) and even more, than the reference drug finasteride (IC50 8.5 nM). Additionally, it was determined that if the degree of unsaturation and conjugation at A and B rings on the steroidal skeleton is increased, it is also beneficial for such activity, finding the compound 7, which bears the highest degree of unsaturation and conjugation due to the 4,6-diene,3-one moiety on it structure, as the most active. It was also found, that the N-cyclohexylcarboxamide analogues 6 to 8 did not have binding affinity for the AR, since they were not able to significantly displace the pattern ligand 17α-methyl-3H-mibolerone from AR binding site. On the other hand, and contrary to expectations, it was found that the androstane analogues 2 to 7 increased the catalytic activity of the 17β-HSD, because they caused an increase in T levels produced from Δ4-androstenedione, when they were present in the reaction mixture. These findings let suggest that the novel N-cyclohexylcarboxamide analogues 6 to 8 modulate two important androgenic paths. On one hand, they produce a slight anabolic effect since they increase T biosynthesis from Δ4-androstenedione through 17β-HSD. On the other hand, they avoid the undesirable androgenic effects of 5α-DHT on prostate due to they are inhibitors of 5αR2, which in turn it is a desired effect for the BPH treatment because it lets to restore the physiological action of T and in addition to reduce the intra-prostatic cell proliferation mechanisms activated by 5α-DHT. Regarding to the in vivo effect of the analogues 2 to 8 on the biosynthesis and action of endogenous androgens, it was found that comparing with F, they did not significantly decreased the growth of pigmented flank organs on male gonadectomized hamsters, treated concomitantly with T. Therefore, they were inactive as inhibitors of the form 1 of 5α-Reductase. In addition, due to they neither decreased the mass indexes for prostate nor seminal vesicles on the treated animals, they lacked of antiandrogenic activity in vivo. The LogP values calculated for both, the novel analogues 5 to 8 and the synthesis intermediates 2 and 3, indicated that they have more affinity for the lipid phase than for the aqueous one, therefore they have lipophillic nature. Due to these values were lower than 1, in conjunction with the fact that their calculated values of transfer free energy derived from LogP were negative, it can be inferred that their passage through biological membranes is thermodynamically propitious and spontaneously occurs by a passive diffusion mechanism. Therefore, it can be assumed that such compounds would not present permeability problems into the body when they are administrated orally. However, since the novel analogues 6 to 8 were inactive in vivo but active in vitro on 5αR2, it allows infer that it is possible that a pharmacokinetic process, related with their metabolism is affecting their bioability and therefore the in vivo activity.