Efecto angiogénico de los medios condicionados por células madre, en el trasplante de aloinjerto óseo diafisario (Modelo Animal)

Abstract

INTRODUCCION: Actualmente el manejo de los defectos óseos continua siendo un reto para el cirujano ortopedista quien a pesar de la introducción de nuevas técnicas quirúrgicas para el manejo de la patología de origen multifactorial, aun se ve limitado en los resultados postoperatorios y funcionales. Con el progreso en el conocimiento de las células madre y el mejor entendimiento de la función y los efectos de la célula mesenquimal , sus capacidades de diferenciación y paracrinas, planteamos la posibilidad de la utilización de éstas dentro del arsenal terapéutico para el manejo de defectos óseos segmentarios. Evaluamos el potencial de los medios condicionados CM por células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo Ad-MCS, como facilitador en el proceso de integración de aloinjertos estructurales diafisarios no vascularizados mediante la promoción de la angiogénesis y consideramos la posibilidad de su utilización dentro del arsenal terapéutico para el manejo de defectos óseos segmentarios. METODOS: Ocho conejos blancos de raza Nueva Zelanda fueron intervenidos quirúrgicamente para realizar la reconstrucción de un defecto óseo diafisario intercalar de 1.5 cm. El primer grupo utilizamos aloinjertos congelados (n=4) y en el segundo aloinjertos congelados + medios condicionados (MC) por células madre mesenquimales (MSC) obtenidas de tejido adiposo humano (Ad-MCS) (n=4) ; fueron observados por 12 semanas. Dos conejos fueron sacrificados al inicio del estudio para utilizar los fémures como aloinjertos donantes. Un segmento cortical diafisario de 1.5 cm fue osteotomizado y luego fijado con ayuda de un tutor externo (diseñado por los autores) compuesto por 4 clavos roscados al hueso. Los aloinjertos fueron despojados del periostio, tejidos blandos adyacentes y del contenido medular, y luego almacenados en bolsas estériles al vacío a -4 °C durante cuatro semanas antes del trasplante. 12 ml de Hidrogel fueron preparados a partir de plasma fresco humano como andamio biodegradable del implante para contener los Medios Condicionados (MC) por Células madre mesenquimales (MCS) de tejido adiposo (Ad-MCS). El Hidrogel con los MC es implantado en el canal medular del aloinjerto y en la superficie cortical en el momento de la reconstrucción femoral del grupo correspondiente. Los conejos fueron sacrificados a la semana 12 y los especímenes analizados macroscópicamente para valorar la integración entre huésped – injerto y la estabilidad de las uniones, también se analizó la formación de callo mediante radiografías control y finalmente practicó un estudio histológico mediante coloración básica H-E y con inmunohistoquimica CD34 y CD31 para evaluar la vitalidad del tejido óseo del huésped y el aloinjerto , la presencia de resorción ósea, neoformación de hueso y tejido fibrovascular además de la densidad de los vasos en el injerto comparándola con hueso no intervenido. RESULTADOS. Se valoraron los 4 especímenes de cada grupo a las 12 semanas. Se encontró formación de callo óseo redundante macroscópica y radiológicamente en la mayoría de especímenes del Grupo B (Aloinjerto + Medios Condicionados) al compararlos con las características de consolidación del Grupo A. Sin embargo, se presentó un caso de aflojamiento del material de fijación asociado a infección en un espécimen de cada grupo. Todos los índices de vitalidad del injerto (formación de osteoide, encapsulamiento del callo y osteocitos vitales en el aloinjerto) fueron significativamente mayores en el grupo de aloinjerto con MC de Ad-MCS en la valoración histológica con H-E. La densidad de los vasos en el aloinjerto y en las zonas de consolidación no fue cuantificable, sin embargo la densidad de tejido positivo para la inmunohistoquímica con CD31 – CD34, fue significativamente mayor en el Grupo B. CONCLUSION. Los aloinjertos con MC de Ad-MCS aumentaron el potencial de integración con el hueso nativo y los índices de vitalidad del aloinjerto. Los marcadores de inmunohistoquimica CD31 y CD34 no permiten cuantificar la densidad vascular por falta de especificidad tisular, sin embargo la mayor captación de contraste en los casos del grupo con MC de Ad-MCS (Grupo B) indica un ambiente enriquecido por una respuesta celular mayor en el sitio de consolidación.

Abstract. INTRODUCTION: Management of bone defects nowadays is still a challenge for the orthopedic surgeon, who despite of introduction of novel surgical techniques to handle the multifactorial origin disease, still have limited postoperative and functional results. With the improvement of knowledge about stem cell and the better understanding of the effects and functioning of mesenchymal cells, their differentiation abilities and paracrine capacity, we pose the possibility of using them on the therapeutic arsenal for managing segmental bone defects. We evaluate the potential of mesenchymal stem cells conditioned medium, coming from fat tissue, as enabling in the process of no vascularized diaphyseal structural allograft integration by promoting angiogenesis, also we consider the possibility of their use in the therapeutic arsenal for managing segmental bone defects. MATERIALS AND METHODS: Experimental study on animal model. Eight 8 white rabbits of New Zeland breed to make reconstruction of a diaphyseal bone defect among 1.5 centimeters, in first group we used frozen allograft (n=4) and in the second group we used frozen allograft plus Mesenchymal Stem Cell´s Conditioned Medium (CM) obtained from human adipose tissue (Ad-MCS) (n=4). They were observed along 12 weeks. 2 rabbits were sacrificed at study beginning to use femurs as allograft donors. A cortical diaphyseal segment of 1.5 cm went through osteotomy and then fixation with an external system designed by authors, constituted by four pins screwed to bone. Periosteum, soft tissue and medulla were removed from allografts, which were stored in sterile vacuum bags, at -4°C along four weeks before transplantation. 12 ml of hydrogel were made from human fresh plasma as implant´s biodegradable scaffold to contain fat tissue stem cell’s conditioned medium. The hydrogel and the conditioned media are placed in allograft´s medullary cavity and in cortical surface at the moment of reassembling femurs in the corresponding group. Rabbits were sacrificed at 12 week and the specimens macroscopically analyzed to evaluate host – graft integration and stability of bonding, besides, we analyzed callus formation by control x- rays and finally we made a histological study by basic eosin - hematoxylin staining and with CD31, CD34 immunohistochemistry to evaluate host bone tissue vitality, the allograft, presence of bone resorption, formation of new bone and fibrovascular tissue. We also evaluate the blood vessels density in the graft comparing with non-operate bone. RESULTS We assess the four specimens of each group at twelfth week. We found redundant bone callus formation macroscopically and with x- rays in most specimens of B group (allograft plus conditioned media) when comparing with characteristics of group A bone consolidation. However, we notice a case of fixation pin slackening associated to infection in one specimen of each group. At histologic staining with eosin hematoxylin, all vitality index of graft (osteoid formation, fibrovascular tissue, bone callus encapsulation and allograft´s vital osteocytes) were significantly high in the group of fat tissue mesenchymal stem cell´s conditioned medium allograft. Vascular density in the allograft and in the consolidation zones were not measurable, however, positive tissue density for immunohistochemistry with CD31 and CD34 was significantly high in group B. CONCLUSION. Fat tissue mesenchymal stem cell´s conditioned medium allografts augmented the integration potential with native bone and allograft vitality indexes. Immunohistochemistry markers CD31 and CD34 don´t allow to quantify vascular density due to lack of tissue specificity, however, the increased capture of contrast in cases with Fat tissue mesenchymal stem cell´s conditioned medium (group B) indicates an enriched environment allowing an increased cell response in consolidation site.