Cuantificación de la expresión del canal de cloruro Lbrm01_v2.0210 y de los canales CLC putativos Lbrm32v2.3670, Lbrm33_v2.1260 y Lbrm04_v2.1010 en promastigotes y amastigotes de L.braziliensis

Abstract

Leishmania es un parásito que genera enfermedades en mamíferos incluyendo humanos conocidas como Leishmaniosis, las cuales pueden llegar a ser fatales y representan un problema de salud pública en Colombia. Durante su ciclo de vida el parásito habita en dos hospederos, el primero es un díptero, donde el parásito está expuesto a pH de 7,0-9,0, temperatura de 25°C y osmolaridad 300 mOsm; el otro hospedero son células mononucleares mamíferas. En éstas habita un compartimiento intracelular (vacuola parasitófora) y experimenta pH ácido 4,5 -5,0, temperatura de ~35-37°C y osmolaridad sugerida de 150 – 250 mOsm. Debido a este cambio de condiciones el parásito pasa de ser promastigote flagelado en el insecto, a amastigote aflagelado en el mamífero manteniendo pH intracelular cercano a neutro, por la alta capacidad tampón de su citoplasma. Esta habilidad de regular pH está relacionada con la función de una bomba protón ATPasa cuya actividad depende de canales de aniónicos. El Grupo de Biofísica y Biología de Membranas registró corrientes de cloruro en ovocitos de Xenopus laevis tras la inyección de ARNm de Leishmania amazonensis y Leishmania braziliensis. Estas corrientes podrían ser el resultado de la actividad de canales/intercambiadores CLC. Por tanto se buscaron canales de cloruro en el genoma de L. braziliensis, encontrándose cuatro genes putativos Lbrm01_v2.0210 (LbCLCA), Lbrm32v2.3670 (LbCLCB), Lbrm33_v2.1260 (LbCLCc) y Lbrm04_v2.1010 (LbCLCD). Las 4 secuencias encontradas codificarían proteínas CLC. LbCLCA, LbCLCB y LbCLCc se transcriben en promastigotes y amastigotes axéncios. En este trabajo se propuso confirmar los hallazgos de transcripción de estos genes en los estadios mencionados y ampliarla mediante la determinación de la expresión de estos CLC durante el ciclo in vitro del parásito. Así mismo cuantificar su expresión génica a nivel de ARNm por RTqPCR absoluta. Para esto se estableció la infección de una línea celular de macrófagos de ratón con L. braziliensis y se siguió a diferentes tiempos. Se obtuvo ARN total que sirvió de plantilla para la síntesis de ADNc que fue amplificado con primers específicos diseñados para cada uno de los genes. Se confirmó la transcripción de LbCLCA, LbCLCB y LbCLCc en promastigotes y amastigotes axéncios así como se reporta por primera vez la transcripción en tiempos tempranos post-infección y amastigotes in situ. Para LbCLCD no se detectaron transcritos en promastigote en estado estacionario cultivado in vitro pero sí en tiempos tempranos post-infección y amastigotes in situ indicando regulación diferencial de este gen en estadios diferentes de Leishmania. A partir de ADNc de promastigote se clonaron productos de ~200 nt de LbCLCA, LbCLCB y LbCLCC para PCR en tiempo real. Se lograron curvas estándar de cuantificación para LbCLCA y LbCLCC, dando como resultado que la expresión de estos genes es mayor durante la primera hora post-infección. En este tiempo el parásito en estadio promastigote estacionario es enfrentando a cambios drásticos de pH, temperatura y quizás osmolaridad que parecen disparar la transcripción de estos dos genes y podrían ser importantes para el proceso de transformación de promatigote a amastigote.

Leishmania is a parasite that generates in mammals a disease known as Leishmaniasis, that has the capability of being fatal and represent a problem of public health in Colombia. Across his life cycle the parasite inhabits in two different hosts the first one, a dipteran where it lives in a pH condition of 7,0-9,0, temperature of 25°C and osmolarity of 300 mosm, the other host are mammal mononuclear cells, there it lives in inside a phagolysosomal compartment (parasitophorus vacuole), with a pH ranged from (4,0 – 5,0), temperatures of ~37°C and an osmolarity of 150 – 250 mOsm, because of this environment change the parasite transform from a flagellated promastigote in the insect, to an aflagellated amastigote in the mammal, maintaining its intracellular pH near to the physiological, because a remarkable buffer capacity of its cytoplasm. This capacity of regulating pH is related with a proton ATP pump whose activity is dependent of anionic channels. Our group of Biofísica y Biología de Membranas has measured chloride currents in ovocites of Xenopus laevis after the injection of mRNA of Leishmania amazonensis and Leishmania braziliensis promastigotes. These currents could be the result channel / exchangers CLC activity. Thus, we searched for chloride channels in the genome of L. braziliensis, founding four putative genes Lbrm01_v2.0210 (LbCLCA), Lbrm32v2.3670 (LbCLCB), Lbrm33_v2.1260 (LbCLCc) y Lbrm04_v2.1010 (LbCLCD). All of them appear to codify for CLC proteins. LbCLCA, LbCLCB and LbCLCc are transcribed in promastigotes and axenic amastigotes. In this study it was proposed to confirm the previous findings about transcription of these genes in the mentioned stages and go deeper in the knowledge by determination of the expression of these CLC during the in vitro life cycle of the parasite. Also to quantify their gene expression at mRNA level by absolute RTqPCR. For this purpose the infection of a murine macrophage cellular line with L.braziliensis at different infection times was established. Total RNA was purified and used as template for cDNA synthesis. Fragments of the genes of interest were amplified with specific primers designed for each one of the genes. The transcription of LbCLCA, LbCLCB y LbCLCc in promastigotes and axenic amastigotes was confirmed as well as seen for the first time in early post-infection times and in situ amastigotes. For LbCLCD there were not transcripts detected in promastigotes in stationary stage cultured in vitro in contrast to early post-infection times and in situ amastigotes where the gene is expressed, indicating differential regulation of this gene in the different Leishmania stages. From cDNA of promastigotes fragments of ~200 nt from LbCLCA, LbCLCB y LbCLCC were cloned for RTqPCR. Standard curves for LbCLCA y LbCLCC, were obtained and the quantification shows that expression of these genes is higher in the first hour post-infection. At this time the parasite is in the promastigote stationary stage and challenged with drastic changes in pH, temperature and maybe osmolarity that appears to trigger the transcription of these two genes that could be important in the process of transformation from promastigote to amastigote.