Caracterización funcional de un canal de cloruro CLC de Leishmania

Abstract

Leishmania spp., abarca organismos unicelulares eucariota con un ciclo de vida caracterizado por dos grandes estadíos (promastigote y amastigote) expuestos a diferencias de pH, osmolaridad y temperatura. Dados estos cambios, se espera que el parásito desarrolle mecanismos regulatorios para su supervivencia. Estudios previos en promastigotes han descrito bombas H+ ATPasas que generan un gradiente electroquímico útil para el transporte secundario de nutrientes (Zilberstein and Shapira, 1994), y que están acopladas a transportadores aniónicos (Vieira, Slotki, and Cabantchik, 1995; Vieira, Lavan, Dagger, and Cabantchik, 1994). Hasta el momento, se conoce poco respecto a la naturaleza molecular o al papel que desempeñan éstas moléculas en la fisiología de Leishmania spp., pero se ha observado que su inhibición, altera transporte de aminoácidos, volumen celular (Vieira, Lafuente, Gamarro, and Cabantchik, 1996), pH intracelular (Vieira et al., 1994), y potencial de membrana (Vieira et al., 1995). Para iniciar el estudio de transportadores aniónicos en Leishmania el grupo de Biofísica y biología de membranas registró corrientes rectificadoras de salida, voltaje y Cl- dependientes, inhibidas por ácido 4,4'- diisotiocianostilbeno- 2,2'-disulfónico (DIDS), luego de la microinyección de mRNA total poliadenilado de promastigotes estacionarios de L. L. amazonensis (Lagos, Moran, and Camacho, 2007) y L. V. braziliensis (Garzón, Stühmer, and Camacho, 2009) en ovocitos de Xenopus laevis. Estas corrientes tienen características electrofisiológicas de canales de cloruro voltaje dependientes o CLC (por sus siglas en inglés). Así, se exploró el genoma de L. V. braziliensis encontrando cuatro secuencias codificantes para canales de cloruro que eran CLC putativas (Quintero, 2014; Parada, 2014; Carreño, 2015). La expresión ha sido verificada para tres de estos genes en promastigotes y para todos ellos en amastigotes in situ de L. V. braziliensis (Carreño, 2015). A la fecha LbCLC-A, LbCLC-B y LbCLC-C han sido clonados (Lozano Jiménez, 2012; Quintero, 2014; Parada, 2014). Este trabajo se enfoca en la caracterización funcional de LbCLC-B. Esta proteína se detecta en estructuras puntiformes intracelulares en promastigotes de L. V. braziliensis. LbCLC-B posee localización diferencial respecto a LbCLC-A y LbCLC-C en promastigotes. Marcajes dobles (golgina 97-LbCLC-B) indican co- localización parcial con el Complejo de Golgi. Su patrón de expresión difiere dependiendo de la etapa del parásito, siendo puntiforme localizado perinuclear y perikinetoplástico en promastigotes en división e inmaduros, para volverse puntiforme distribuido en todo el citoplasma en promastigotes maduros. Se sugiere además que LbCLC-B es reclutada durante lesión celular por daño osmótico. Inyección de cRNA LbCLC-B en ovocitos de X. laevis altera su volumen. Registros electrofisiológicos de voltage clamp con dos electrodos 48 horas post-inyección muestran corrientes rectificadoras de salida, voltaje dependientes que se incrementan a pH 5 y cuyo potencial de reversión es sub- nernstiano sugestivo de actividad como intercambiador. Se encontró evidencia de la participación de LbCLC-B en la regulación del volumen en promastigotes de Leishmania mediante ensayos de interferencia en la expresión. Se escogieron dos líneas de parásitos que presentaban alteraciones en el patrón de expresión de α-tubulina. En una de estas líneas se encontró una disminución regulatoria del volumen inducida en medio hipotónico sugestivo de interferencia. Con base en los hallazgos se propone que LbCLC-B estaría involucrado en la regulación del volumen.

Abstract. Leishmania spp., are unicellular eukaryotic organisms with a life cycle characterized by two major stages (promastigote and amastigote) exposed to differences in pH, osmolarity and temperature. Given these changes, it is expected that the parasite develop regulatory mechanisms for survival. Previous studies in promastigotes described H+ATPase pumps that generate an electrochemical gradient, useful for secondary transport of nutrients (Zilberstein and Shapira, 1994), coupled to anionic transporters (Vieira, Slotki, and Cabantchik, 1995; Vieira, Lavan, Dagger, and Cabantchik, 1994). Little is known about the molecular nature and the role of these molecules in the physiology of Leishmania spp., but it has been observed that their inhibition alters amino acid transport, cell volume (Vieira, Lafuente, Gamarro, and Cabantchik 1996), intracellular pH (Vieira et al., 1994), and membrane potential (Vieira et al., 1995). To begin the study of anionic transporters in Leishmania our group recorded outward rectifying currents, voltage and Cl- dependent, inhibited by 4'- diisothiocyano-2,2'-stilbene disulfonic acid (DIDS) after microinjection of total polyadenylated mRNA from stationary promastigotes of L. L. amazonensis (Lagos, Moran, and Camacho, 2007) and L. V. braziliensis (Garzón, Stühmer, and Camacho, 2009) in Xenopus laevis oocytes. These currents have electrophysiological characteristics of voltage dependent chloride channels or CLC. Thus, L. V. braziliensis genome was explored finding four putative coding sequences for CLCs (Quintero, 2014; Parada, 2014; Carreño, 2015). The expression has been verified for three of these genes in promastigotes and for all in in situ amastigotes of L. V. braziliensis (Carreño 2015). LbCLC-A, LbCLC- B and LbCLC-C have been cloned (Lozano-Jiménez, 2012; Quintero, 2014; Parada, 2014). This work focused on the functional characterization of LbCLC-B. This protein was detected in punctate intracellular structures in L. V. braziliensis promastigotes. LbCLC-B location is different to LbCLC-A and LbCLC-C in L. V. braziliensis promastigotes. Double markings (golgin 97-LbCLC-B) indicate partial colocalization with the Golgi apparatus. Its expression pattern differs depending on the stage of the parasite, being punctate perinuclear and perikynetoplastic in division and immature promastigotes, to become punctate distributed throughout the cytoplasm in mature promastigotes. It is further suggested that LbCLC-B is recruited during cell injury by osmotic damage. Injection of cRNA LbCLC-B of X. laevis oocytes induces volume alteration. Two electrode recordings in voltage clamp after 48 hours of injection showed an outward rectifying current, voltage dependence at pH 5 with sub- Nernstian reversal potential suggestive of exchanger activity. Evidence of LbCLC-B participation in volume control in Leishmania promastigotes by interference tests was found. Two lines of parasites showing alterations in the pattern of expression of α-tubulin were chosen. In one of these lines regulatory volume decrease was found induced in hypotonic medium suggestive of interference. Based on the findings it is proposed that LbCLC-B would be involved in volume regulation.