Evaluación del efecto del silenciamiento del gen RhoB (Ras Homology Family Member B) sobre el fenotipo de infección de macrófagos derivados de células U937 infectados por Leishmania (Viannia) braziliensis

Abstract

El desarrollo de mecanismos de prevención y control de las leishmaniasis se ha dificultado en parte por las pocas opciones terapéuticas y por los vacíos en el conocimiento de la interacción entre el parásito y el hospedero. El parásito posee varios mecanismos para modular la respuesta del macrófago, entre estos, la alteración de la expresión genética del macrófago durante la infección. En un trabajo previo del grupo de investigación, por análisis de microarreglos se reportaron los cambios en la expresión de genes de macrófagos derivados de células U937 infectados durante 72 horas con Leishmania Viannia braziliensis. A partir de estos resultados se seleccionó un grupo de genes para ser validados funcionalmente durante la infección in vitro. El gen RhoB que codifica para una pequeña GTPasa hace parte de un grupo de genes expresados diferencialmente entre macrófagos infectados y no infectados. El control de la expresión de esté gen está relacionado con la síntesis del colesterol, proceso que se ha reportado como alterado durante la infección. El objetivo de este trabajo fue validar de manera cuantitativa los niveles de expresión del gen RhoB en los macrófagos infectados y determinar el efecto del silenciamiento genético de RhoB sobre el fenotipo de infección, medido éste como carga parasitaria y porcentaje de infección en los macrófagos infectados con L. (V.) braziliensis. Los niveles de expresión del gen RhoB fueron medidos por PCR en tiempo real en macrófagos entre las 0 y las 120 horas después de la infección in vitro, con el fin de describir la cinética de expresión del gen durante la infección. Posteriormente, se utilizó transducción lentiviral para generar líneas celulares derivadas de U937 con expresión constitutiva de shRNAs dirigidos contra RhoB. El silenciamiento de RhoB y la cantidad de RhoB-activa en las líneas celulares fue determinado por western blot y ensayo de pull-down. Las líneas celulares con mayor nivel de silenciamiento fueron infectadas in vitro para determinar mediante tinción fluorescente y análisis de imágenes el efecto del silenciamiento sobre el porcentaje de infección y la carga parasitaria. Los resultados evidenciaron que el gen RhoB no presenta cambio en su expresión en los macrófagos entre las 0 y las 24 horas después de la infección, pero si se sobre-expresa entre las 48 y las 96 horas, resultados concordantes con los obtenidos previamente con microarreglos. Mediante la evaluación funcional usando shRNAs se encontró que el silenciamiento de RhoB se asocia con reducción en la carga parasitaria y en el porcentaje de infección in vitro. Estos resultados permiten preguntarse si la expresión del gen RhoB podría relacionarse con el establecimiento de la infección, teniendo cuenta que el intervalo de tiempo en que se sobre-expresa el gen coincide con el intervalo reportado en el que los amastigotes se multiplican activamente en el macrófago. Abstract: The development of mechanisms for prevention and control of leishmaniasis has been hampered in part by the few therapeutic options and gaps in the knowledge of the interaction between the parasite and the host. The parasite has several mechanisms to modulate macrophage response, among these, altered macrophage gene expression during infection. In a previous work of the research group, were reported the changes in the expression of genes derived macrophages infected U937 cells for 72 hours with Leishmania Viannia braziliensis by microarray analysis. From these results, a group of genes to be functionally validated for in vitro infection was selected. The RhoB gene encodes a small GTPase is part of a group of genes differentially expressed between infected and uninfected macrophages. The expression controlling of this gene it is associated with cholesterol synthesis, a process that has been reported as altered during infection. The aim of this study was to quantitatively validate the levels of RhoB gene expression in infected macrophages and determine the effect of RhoB gene silencing on the phenotype of infection, measured as parasite load and percentage of infection in L. (V.) braziliensis infected macrophages. The expression levels of the RhoB gene were measured by real-time PCR in macrophages between 0 and 120 hours after in vitro infection, in order to describe the kinetics of gene expression during infection. Subsequently, lentiviral transductions were used to generate cell lines derived from U937 with constitutive expression of shRNAs directed against RhoB. RhoB silencing and the amount of RhoB-active in the cell lines was determined by western blot and pull-down assay. Cell lines with higher silencing was infected in vitro to determine the effect on the rate of infection and parasite load by fluorescent staining and image analysis silencing. The results showed that RhoB was not change in gene expression in macrophages between 0 and 24 hours after infection, but is over-expressed between 48 and 96 hours, consistent with the results previously obtained by microarrays. The RhoB gene silencing was associated with reduction in parasite load and percentage of in vitro infection. These results raise the question whether RhoB gene expression could be related to the establishment of infection, taking account that the time interval in which over-expresses the gene matches the reported range in which they thrive amastigotes in macrophage.