Efecto del estrés oxidativo en la resistencia multidrogas en células de cáncer de colon HT29

Abstract

La resistencia a fármacos antineoplásicos es un problema frecuente en el uso de la quimioterapia en cáncer. Esta se relaciona con factores como: 1) la activación de la resistencia a multidrogas (MDR: Multiple Drug Resistance) asociada a la presencia de transportadores unidos a adenosín trifosfato ATP (transportadores ABC) como la glicoproteína P (Pgp P-Glycoprotein) entre otros, que expulsan el fármaco al exterior de las células; 2) la heterogeneidad del tejido; 3) el microambiente tumoral; 4) la respiración mitocondrial anormal; 5) la vascularización; 6) los mecanismos de reparación del Ácido desoxirribonucleico DNA (Deoxyribonucleic acid) y 7) la apoptosis. Diversos estudios han demostrado que la señalización celular, que conduce a estos procesos moleculares, depende de la respuesta celular al estrés oxidativo generado y a la regulación que pueda efectuarse. Las especies reactivas de oxígeno (ROS: Reactive Oxygen Species) oxidan componentes celulares como el DNA, las proteínas y los ácidos grasos. En el caso de las proteínas, estas al ser oxidadas modifican su función normal, generando efectos en la señalización celular e incrementando aún más el estrés oxidativo. La modulación de ROS podría ser no sólo un pre-requisito para el desarrollo del tumor sino una medida de la Resistencia a multidrogas. En este proyecto se realizó un estudio in vitro, con células de cáncer de colon HT29 las cuales fueron sometidas a condiciones de hipoxia química y/o incubación con Doxorrubicina, con el fin de generar estrés oxidativo, el cual fue evaluado a través de la medición de niveles de ROS. Se hizo una determinación del efecto que tiene el aumento en los niveles de ROS frente a la expresión de los transportadores ABC Pgp y BCPR (Breast Cancer Resistance Protein o Proteína de Resistencia de Cáncer de Mama). Adicionalmente y considerando que en la resistencia a multidrogas pueden existir mecanismos de evasión de la apoptosis asociados al estrés oxidativo, se evaluó el efecto de estos tratamientos sobre la expresión de las proteínas proapoptóticas PUMA (modulador de apoptosis sobre regulado por p53) y Bax (Proteína X asociada con la proteína 2 de linfoma de células B Bcl-2). Teniendo en cuenta que la respuesta a hipoxia conduce a la activación del factor inducible por hipoxia (HIF1α) como regulador de la señalización, en este estudio se hizo la evaluación de su actividad y su relación con la resistencia a multidrogas. Como respuesta al estrés oxidativo se ha evaluado la endonucleasa humana APE-1 (Endonucleasa apurínica apirimidínica de mamíferos). Esta es una enzima con actividad reparadora del DNA y con actividad en la regulación transcripcional de diferentes factores de transcripción. Su sobreexpresión se ha visto en células tumorales y confiere resistencia a varios fármacos usados en la terapia anti cáncer; por lo cual, se considera que la resistencia a multidrogas podría estar ligada a la función de APE-1, que además regula la activación del gen de resistencia a multidrogas MDR1, que codifica para el transportador Pgp. En este trabajo se determinó el efecto de la actividad redox de la endonucleasa APE-1 a través de su inhibición, en los niveles de ROS y en la resistencia multidrogas mediada por los transportadores ABC Pgp y BCPR. Esta es una vía que tiene gran importancia ya que puede considerarse como una ruta alternativa que utilizan las células tumorales y que incrementaría aún más la MDR. Finalmente, se buscó determinar el efecto de las ROS sobre la expresión de transportadores ABC a través del uso del antioxidante N-Acetilcisteína. Estos resultados permitieron sugerir un modelo hipotético en el cual 1) la generación de ROS inducidas por Doxorrubicina en normoxia e hipoxia química podrían activar mecanismos de resistencia a multidrogas y 2) la respuesta al estrés oxidativo mediada por APE-1 podría regular la expresión, localización en membrana o actividad de Pgp y BCRP. Adicionalmente se plantea que el factor de transcripción HIF1α podría generar cambios en la activación de la vía apoptótica asociada al tratamiento con Doxorrubicina. Estas alteraciones en los transportadores y en la activación de la vía apoptótica asociados al estrés oxidativo, estarían asociados con la resistencia multidrogas en células de cáncer de colon.

Abstract. The resistance against antineoplasic drugs is a common problem in the use of chemotherapy in cancer. This is related to factors such as: 1) the activation of multidrug resistance (MDR: Multiple Drug Resistance) associated with the presence Adenosine triphosphate ATP-Binding Cassette transporters (ABC Transporters) as the P-glycoprotein (Pgp) among others, which allows the efflux of the drug outside of the cells; 2) heterogeneity of the tissue; 3) the Tumor Microenvironment; 4) the abnormal mitochondrial respiration; 5) vascularization; 6) Deoxyribonucleic acid DNA (Deoxyribonucleic acid) repair mechanisms and 7) apoptosis. Several studies have shown that the cellular signaling that leads to these molecular processes depends on the cellular response to oxidative stress and its regulation. Reactive Oxygen Species (ROS: Reactive Oxygen Species) oxidize cellular components such as DNA, proteins, and fatty acids. In the case of proteins, oxidation modifies their normal function, generate effects in cell signaling and further increase the oxidative stress. ROS modulation could not be only a prerequisite for the development of the tumor but could be also a measure of resistance to drugs. This project was an in vitro study of HT29 colon cancer cells which were subjected to conditions of hypoxia and/or incubation with Doxorubicin in order to generate oxidative stress which was evaluated through ROS levels measure. It was evaluated the effect of increasing ROS levels on the Pgp and BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) expression. Additionally, and considering that drug resistance could involve apoptosis evasion mechanisms associated with oxidative stress, the effect of these treatments on the expression of the pro-apoptotic proteins PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis) and Bax (B-cell lymphoma-2 protein associated X protein) was evaluated. The response to hypoxia induces the activation of the Hypoxia Inducible Factor (HIF1α) as a regulator of signaling, for that reason HIF1α activation and its relation to drug resistance were evaluated. In addition, as a mechanism of response to oxidative stress, the APE-1 (Apurinic/Apyrimidinic) endonuclease, was evaluated. This endonuclease is an enzyme with DNA repair and transcriptional regulation activity on different transcription factors. Its overexpression has been noted in tumor cells and confers resistance to several drugs used in anticancer therapy; according to this, it has been postulated that resistance to drugs could be linked to the APE-1 function which regulates the activation of the MDR1 multidrug resistance gene, which encodes for the Pgp transporter. In this work, it was determined the effect of the APE-1 redox activity, on ROS levels and on the drug resistance mediated by the ABC transporters Pgp and BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) through APE-1 inhibition. This pathway has a great relevance because it could be considered as an alternative route used by the tumor cells and would further increase the MDR. Finally, we sought to determine the effect of ROS on the expression of ABC transporters using the antioxidant N-acetylcysteine. These results allowed us to suggest a hypothetic model where 1) ROS generation induced by Doxorubicin in normoxic and chemical hypoxic conditions could activate drug resistance mechanisms and 2) response to oxidative stress mediated by APE-1 could regulate expression, membrane localization or activity of Pgp and BCRP. Additionally, it was proposed that HIF1α could be associated with changes in the apoptotic pathway activation in response to Doxorubicin treatment. These alterations in the transporters levels and in the apoptotic pathway could be related to multidrug resistance in colon cancer cells.