Potencial de las ATPasas tipo P como dianas terapéuticas o en el diseño de mutantes atenuados de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

El objetivo principal de esta Tesis fue elucidar la función de algunas enzimas ATPasas tipo P de Mycobacterium tuberculosis involucradas en el transporte de cationes de metales alcalinos/ alcalinotérreos. Estos iones, Na+, K+, Ca2+ y Mg2+, son requeridos por todas las células porque juegan papeles esenciales en un sinnúmero de procesos fisiológicos incluyendo funciones estructurales, regulatorias y de señalización. Por ello su concentración intracelular debe ser mantenida cuidadosamente para evitar desbalances que desemboquen en efectos deletéreos para la célula. En respuesta a ello, las células han desarrollado estrategias para mantener un equilibrio de entrada y salida de cationes que incluyen sistemas de transporte activo fundamentales para la virulencia de patógenos intracelulares, una posible explicación del gran número de ATPasas tipo P del bacilo tuberculoso. De las 12 bombas tipo P codificadas en el genoma de M. tuberculosis, 7 son transportadores de metales de transición del tipo P1B, 4 transportadores de cationes alcalinos/alcalinotérreos P2/3 (CtpE, CtpF, CtpH, CtpI) y KdpB, una subunidad catalítica del transportador de K+ del tipo P1A. De ellas, solo se han caracterizado 5 transportadores de metales pesados implicados en la virulencia de M. tuberculosis, en tanto que ningún estudio se ha encaminado a caracterizar alguna de las 4 enzimas predichas como transportadores tipo P2/3. Por ello, el presente proyecto se orientó a establecer características funcionales de las ATPasa tipo P CtpE, CtpH y CtpF como posibles transportadores implicados en el control de los niveles intracelulares de cationes alcalinos/alcalinotérreos. CtpE, por ser la bomba más divergente con respecto a las ATPasas tipo P de humano; CtpH, por ser una bomba particularmente grande y exclusiva de bacterias; y CtpF, cuyo gen es quien sufre los cambios transcripcionales más drásticos en respuesta a condiciones de estrés relacionadas con la infección. La estrategia general fue el análisis fenotípico de la sobreexpresión y deleción del gen de interés, además de ensayos de actividad enzimática sobre proteína ensamblada en membrana plasmática confrontados con predicciones bioinformáticas de especificidad iónica. Nuestros resultados nos permitieron proponer que CtpE es una Na+ ATPasa relevante durante el estrés osmótico al que la micobacteria se puede enfrentar durante su ciclo de vida; en tanto que CtpH y CtpF son Ca2+ ATPasas, aparentes participantes en la red de respuesta micobacteriana al estrés oxidativo, una de las condiciones que enfrentan los patógenos intracelulares durante el proceso de infección. En adición, establecimos que existe una relación entre el factor de virulencia MgtC de M. tuberculosis y la actividad ATPasa; sin embargo, no parece ser un efecto directo sino más bien una consecuencia de la función principal del MgtC en la adaptación temprana a bajas concentraciones de Mg2+ y pH ácido. En general se sugiere que las proteínas MgtC, CtpE, CtpH y CtpF participan en respuestas concertadas a condiciones de estrés enfrentadas por M. tuberculosis durante el transcurso de la infección. Además debido a que la mayoría están ausentes (MgtC, CtpE y CtpH) o son considerablemente divergentes respecto a sus homólogos en células eucariotas (CtpF), constituyen un punto de vulnerabilidad que puede ser explotado por nuevas quimioterapias para el control de las infecciones causadas por patógenos del género Mycobacterium.

Abstract. The main goal of this thesis was to elucidate the function of some P-type ATPases of Mycobacterium tuberculosis involved in the transport of alkaline/alkaline earth metal cations. These ions, Na+, K+, Ca2+ and Mg2+, are required by all cells because they play essential roles in a number of physiological processes including structural, regulatory and signaling functions. Therefore their intracellular levels must be carefully maintained to avoid dyshomeostasis that lead to deleterious effects for the cell. In response, cells have developed strategies to maintain an inlet and outlet equilibrium of cations that include active transport systems critical for virulence of intracellular pathogens; possible explanation for the large number of P-type ATPases of M. tuberculosis. There are 12 P-type pumps encoded in the M. tuberculosis genome. From those, 7 are P1B type transition metal cation transporters, 4 are P2/3 alkaline/ alkaline earth metal cation transporters (CtpE, CtpF, CtpH, CtpI) and KdpB, a subunit of the bacterial K+ transporter, type P1A. Only 5 P1B heavy metal transporters have been characterized, some of them involved in the virulence of M. tuberculosis, while no studies have been done to characterize any of the 4 enzymes predicted as P2/3 type transporters. Therefore, our aim was to establish functional characteristics of the CtpE, CtpH and CtpF P-type ATPases as possible transporters involved in the control of intracellular levels of alkaline/alkaline earth cations. CtpE, because it is the most divergent pump compared to human P-type ATPases; CtpH, for being a particularly large and exclusive pump of bacteria; and CtpF, whose gene is the one who undergoes the most drastic transcriptional changes in response to stress conditions related to infection. The overall strategy was the phenotypic analysis of overexpression and deletion of the gene, as well as enzymatic activity assays on plasma membrane embedded protein confronted with bioinformatics predictions of ionic specificity. Our findings allowed us to propose that CtpE is a Na+ ATPase relevant during the osmotic stress that the mycobacteria face during its life cycle; and that CtpH and CtpF are Ca2+ ATPases, apparently involved in the mycobacterial response network to oxidative stress, one of the conditions faced by intracellular pathogens during the infection process. In addition, we established that there is a relationship between the MgtC virulence factor of M. tuberculosis and the ATPase activity. However, does not appear to be a direct effect but rather a consequence of the main function of MgtC in the early adaptation to low concentrations of Mg2+ and acid pH. In general, MgtC, CtpE, CtpH and CtpF proteins participate in concerted responses to stress conditions faced by M. tuberculosis during the infection course. In addition, because most are absent (MgtC, CtpE and CtpH) or are considerably divergent from their counterparts in eukaryotic cells (CtpF), they constitute a point of vulnerability that can be exploited by new chemotherapies for the control of infections caused by pathogens from the Mycobacterium genus.