Terapia génica y microambiente tumoral: efecto de los cambios en la proliferación celular sobre la expresión y localización del cotransportador sodio/yodo en un modelo in vitro de cáncer de colon

Abstract

El cotransportador sodio-yodo (NIS) es una proteína que cataliza un transporte activo de yodo, hacia el interior de la célula, aprovechando el gradiente de sodio creado por la bomba sodio/potasio. Se localiza a nivel basolateral en diferentes tipos celulares, pero principalmente en células foliculares de tiroides. Por su capacidad de acumulación de yodo, esta proteína ha sido ampliamente utilizada como herramienta diagnostico-terapéutica contra el cáncer de tiroides. Dada su funcionalidad, la utilización de radioisótopos de yodo es una herramienta altamente efectiva. Hoy en día su aplicabilidad en otros tipos de cáncer es prometedora debido a la implementación de la terapia génica. con el fin de evaluar la efectividad de la terapia génica basada en la introducción heteróloga de la proteína NIS, investigadores de la unidad TIRO de la Université de Nice – Sophia Antipolis, generaron una línea celular a partir de células de la línea de carcinoma de colon HT29, transfectándolas establemente con el transportador NIS (HT29-NIS). Esta línea ha sido utilizada para generar tumores en ratones con el fin de evaluar la efectividad de esta herramienta. Los resultados de estos estudios permitieron establecer que la función del transportador no es homogénea a lo largo de los tumores generados, observándose una mayor captación de yodo en las zonas externas del tumor, y una captación muy baja o nula al interior del mismo. Una de las posibles fuentes de variación puede ser la heterogeneidad tumoral, un fenómeno que hace referencia a la variedad de fenotipos de las células tanto cancerígenas como de los otros tipos celulares que conforman el microambiente tumoral. Dado este contexto, el objetivo de este trabajo fue determinar los posibles efectos de cambios en la proliferación celular sobre la expresión y localización de NIS in vitro. Para ello, las diferencias en la proliferación se simularon mediante la disminución de suero en el medio de cultivo. Por otro lado, para evaluar la expresión y localización de NIS se aplicaron metodologías de Western Blot e Inmunocitoquímica. Los cambios en el estado de proliferación de las células HT29-NIS generaron variaciones en el ii patrón de expresión y en la localización intracelular del transportador, posiblemente asociados con variaciones en su estado de glicosilación. Esta observación, sugiere que posiblemente una o más rutas de señalización asociadas a la proliferación celular pueden ser responsables de algún tipo de regulación sobre el transporte de yoduro en los tumores de células HT29-NIS generados en ratones. Con base en lo anterior, se realizó una búsqueda de posibles rutas de señalización asociadas tanto con la regulación de la proliferación como con la regulación del transportador. Una de las rutas de señalización que sobresalió fue la ruta PI3K/AKT, ya que en diferentes modelos celulares puede regular la expresión de NIS y además es una ruta de señalización ampliamente asociada a la proliferación celular. Por ello, se utilizó Wortmanina, inhibidor de ésta para tener una aproximación al efecto de su inhibición sobre la expresión del transportador. La acción de tal inhibidor no mostró diferencias significativas sobre la expresión ni el patrón de expresión del cotransportador. En conjunto, estos experimentos permiten un acercamiento inicial a uno de los fenómenos que puede estar afectando negativamente la aplicación de radioterapia metabólica basada en NIS: el estado proliferativo de las células, nunca dejando de lado los conceptos de heterogeneidad tumoral y microambiente tumoral.

Abstract. Sodium-Iodide symporter (NIS) a protein that actively cotransports sodium and iodide has been widely used as a diagnostic and therapeutic tool against thyroid cancer. Mostly, NIS is expressed in thyroid follicular cells as a transmembrane protein. Because of its functional mechanisms the utilization of iodide radioisotopes as thyroid cancer therapy is a highly effective tool. Nowadays its usability in other cancer types becomes promising due to the utilization of genetic therapy. Previous to this research work, researches at TIRO unit in Universitè Sophie Antopolis generated an HT29 cell line transfected with NIS symporter (HT29-NIS). This cell line has been used to generate xenografts in order to assess the effectivity of this tool. However, the function of the symporter is not homogeneous along the xenografts. One of the possible sources of variation might be the tumor heterogeneity. This phenomenon is described as the variety of phenotypes present in the tumor forming cells and the tumor stroma and microenvironment cells. Given this context, the aim of this study was to assess the possible effect of proliferation changes on NIS symporter expression and localization in vitro. In order to do so, decreasing serum supplementation percentage in the culture media simulated the different proliferation states. Western Blot and Immunocytochemistry determined NIS expression and subcellular localization. Changes in the proliferation state of HT29-NIS cells generated variations on the expression pattern and intracellular localization of NIS protein, possibly associated with its glycosylation state. These results suggest that proliferation-related pathways might be associated with the heterogeneous transport of iodide on HT29-NIS xenografts. Having in mind the suggestion above, a wide search about signaling pathways regulating proliferation and NIS expression was held. As a result the PI3K/AKT pathway was one of the signaling pathways that meet our criteria. In order to test the effects of inhibiting this pathway we apply Wortmannin as the inhibitory agent. It didn’t yield significant variations on the expression or expression pattern of the transporter. As a hole, this experiments shed a light into one of the different phenomenon negatively affecting the application of NIS-based metabolic radiotherapy: the cellular proliferative state, never leaving appart its association with tumor heterogeneity and tumoral microenvironment.