Determinación de leishmaniavirus en biopsias y aislamientos de pacientes con diagnostico confirmado de leishmaniasis mucosa y de pacientes con diagnóstico de leishmaniasis cutánea en falla terapéutica

Abstract

La leishmaniasis es una enfermedad de transmisión vectorial, endémica en regiones tropicales y subtropicales, que puede tener compromiso en piel, mucosa y vísceras dependiendo de la especie infectante y la condición inmunológica del huésped. Es una enfermedad de baja mortalidad y alta morbilidad con cerca de 2.4 millones de años de vida ajustados por discapacidad. En Colombia la forma cutánea aporta el 95% de los casos reportados anualmente y aunque su pronóstico es más favorable se presentan como principales complicaciones la falla terapéutica o no respuesta al tratamiento y la producción de cuadros con compromiso mucoso. La falla terapéutica o no respuesta al tratamiento se registra en alrededor del 25% de los casos tratados con antimoniato de meglumina, primeria línea de tratamiento en el país. La respuesta al tratamiento está asociada a múltiples factores que incluyen la especie del parásito, la edad y estatus inmunológico del huésped, la localización de las lesiones y la vía de administración y duración del tratamiento. Del 3-10% de las personas que padecen Leishmaniasis cutánea (LC) pueden desarrollar leishmaniasis mucosa (LM) de manera concomitante o tardía. Esta forma complicada de la LC que se caracteriza por afectar principalmente la mucosa nasofaríngea, es producto de una diseminación linfo-hematógena de los parásitos de Leishmania spp. a partir de una lesión cutánea distante o del inoculo del parásito en proximidad de las regiones nasal u oral. En Colombia representa el 1.3% de los casos de Leishmaniasis según informó el Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Pública (SIVIGILA) para el año 2015. Esta complicación es de gran impacto en la población por ser altamente deformante e incapacitante. La presentación de la complicación LM es considerada de origen multifactorial, involucrando componentes asociados tanto al huésped como al parásito. Actualmente una hipótesis que ha tomado fuerza para explicar las complicaciones de la LC, ya sea la falla terapéutica y/o el compromiso a nivel mucoso, es la infección del parásito infectante por un virus de familia Totiviridae y género Leishmaniavirus. Este virus podría estar involucrado en una exacerbación de la respuesta inmune y la persistencia del parásito en los macrófagos. Sin embargo las frecuencias reportadas del virus varian entre 0 y e 87% en los pacientes con LM o LC en falla terapéutica, hecho que refleja una alta variablidad en la presencia del virus que puede deberse a multiples factores incluyendo componenetes técnicos asociados a la muestra y el método usado para la detección viral. El presente estudio pretendió determinar la frecuencia con la que se detecta el virus en una serie de biopsias y aislamientos parasitarios provenientes de pacientes con LM o LC en falla terapéutica. Lo anterior fue posible mediante la combinación de técnicas de RTPCR y RT-qPCR que han sido descritas de manera individual en la detección de los virus pertenecientes a este género. Se describen los hallazgos obtenidos al analizar un total de 31 muestras clinicas: 10 biopsias de pacientes con LM, 6 aislamientos parasitarios a partir de lesiones mucosas y 15 aislamientos parasitarios a partir de pacientes que presentaron falla terapéutica o recidiva al tratamiento con Glucantime®. Se construyó un algoritmo diagnóstico que permitió detectar el virus en el 56.67% del total de las muestras analizadas, las cuales estaban infectadas por parásitos de la especie L. (V.) braziliensis, L. (V.) panamensis y Leishmania sp. y no se detectó un patrón de distribucion geográfico predominante. En los aislamientos parasitarios asociados a la falla terapéutica o recidiva en las lesiones cutáneas tratadas con Glucantime®, la presencia viral no se relacionó con el porcentaje de infectividad ni con la sensibilidad “in vitro” de los amastigotes intracelulares al Glucantime®

Abstract. Parasites from leishmania genus are associated with pleiomorphic human disease with visceral or cutaneous manifestations. The clinical behaviour of the disease depends on host’s factors and on parasites species. Leishmania genus has a worldwide distribution on tropical regions, however the species circulating at the Old world have differences with those found at the New world, particularly with species grouped into the Leishmania Viannia subgenus. Those last are predominant in South America where they generate complicated cutaneous forms of the diseases as mucosal (ML) form and non-responding cutaneous leishmaniasis (NRCL) without parasite resistance. The occurrence of the above-mentioned complications could be associated with the presence of a cytoplasmic virus in the infecting parasite, known as Leishmania RNA virus (LRV1). However the frequency of the virus in clinical samples ranges from 0 to 87% without regular data that strongly support association. Those apparent inconsistent results could obey to: the use of a diverse sort of experimental approaches, overlooking the parasite species factor and the type of clinical samples that had been analysed. In order to avoid detection bias when looking for LRV1 in clinical samples, the present study used complementary approaches to assurance the reliability in the LRV1 frequency informed. Taking into the account the parasites species and looking for differences in the result when the source sample corresponds with isolates parasite of with lesion biopsies. Also to determine the impact of the LRV-1-infection on the amastigote fitness, the percentage of infections on human macrophages has been assessed as their in vitro susceptibility to the first choice drug in South America for this parasite, Glucantime®. 31 samples were analysed from different clinical background 16 samples from patients with ML (10 biopsies and 6 isolates), 15 from patients with NRCL and 1 reference isolate. Analysing data by type of approach LRV1 observed frequencies were in RT-PCR and RTqPCR: 42.86%. Nested PCR: 88.8%. By clinical condition ML: 73.3%, NRCL: 40%. By type of sample: biopsies: 88.8% and isolates: 42.86%, by parasite species: L. (V.) braziliensis: 76,4%, L. (V.) panamensis: 11,76% y Leishmania sp.: 11,76%. Using One-way ANOVA on ranks, nor differences in Infectivity to the macrophages (p=0.523) neither in Glucantime® susceptibility (p=0.728) were observed between L. braziliensis-LRV1 positive (median value of infectivity 47.7% and of IC50, 120.7 ug/ml) and L. braziliensis-LRV1 negative (median value of infectivity 44.9% and of IC50, 121.6 ug/ml). Suggesting that the presence of the virus does not affect intracellular parasite fitness at least at those levels. Findings from the present study indicate that LRV-1 detection is highly dependent on the type of sample, the parasite load and the experimental approach. They also suggest that LRV1 is associated to L. (V.) braziliensis linked to ML in a higher frequency than to parasites from same species related to NRCL. Also there is a higher detection of the virus in biopsies than in isolates and this was always found in L. (V.) braziliensis but not L. (V.) panamensis.