Evaluación del efecto antiresortivo de NAC en células similares a osteoclastos obtenidas por fusión con PEG o por fuerza centrifuga

Abstract

Previamente mostramos que la fusión inducida con Polietilenglicol (PEG) de macrófagos tanto de las líneas U937/A y J774 conducía a la diferenciación y activación de osteoclastos de acuerdo con la expresión de marcadores de osteoclastos como la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) y la actividad de resorción óse a, por otro lado al someter células de fibroblastos gingivales a fuerzas centrifugas se observó marcadores osteoclásticos como presencia TRAP y actividad resortiva. Se ha identificado que para que suceda la diferenciación hacia osteoclasto es necesario el aumento de las concentraciones intracelulares de especies reactivas de oxigeno (ROS). En el momento no hay un modelo experimental que explique el papel de ROS en la diferenciación osteoclástica cuando se aplican fuerzas como en los tratamientos de ortod oncia. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto antiresortivo de NAC (n acetil cisteina) en células similares a osteoclastos obtenidas por fusión con PEG o en células sometidas a fuerzas centrifugas. Células U937 fueron sembradas sobre lámi nas de hueso cortical de origen bovino y sometidas a fuerzas compresivas. Paralelamente otra fracción de células se fusionó con PEG 1450 y a otra porción no se les aplicó ningún tratamiento y fueron cultivadas en similares condiciones (grupo control), los grupos expuestos anteriormente fueron tratados o no con 30 mM del fármaco anti-oxidante N-acetil cisteína (NAC), se evaluó la actividad TRAP, la actividad resortiva ósea, la presencia de anillos de actina por medio de fluorescencia indiceta, y la expresión de marcadores poblacionales exclusivos de osteoclastos por medio de inmunofluorescencia indirecta. Los niveles ROS fueron evaluados mediante el reactivo DHE ( Hydroethidine), la fusión celular se evaluó mediante el uso de los marcadores DiD y DiO . La diferencia de los grupos de los tratamientos fue analizada por el método de ANOVA de doble vía. Para evaluar el grado de correlación entre las variables se realizó una prueba de correlación de Tuquey. Encontramos que la fusión celular per se, de células U937, con PEG 1450 o al aplicar fuerza compresiva, induce características similares a la de los osteoclastos como generar anillos de actina, aumentar la actividad ROS, formar células multinucleadas TRAP positivas, aumentar la expresión de NF-kB, así como, el de marcadores poblacionales característicos evaluados, al aumentar la actividad de resorción en láminas de hueso cortical bovino. Sin embargo, los patrones de resorción y de fusión son diferentes al tratar con PEG o someter a fuerzas com presivas. Al tratar estas mismas células con 30mM de NAC todos los efectos se revirtieron observándose diferencias altamente significativas P0.001. Fusionar células con PEG o someterlas a fuerza centrífuga genera estrés oxidativo (producción de ROS ) lo cual activa vías relacionadas con la maduración del osteoclasto (anillos de actina TRAP, resorción y marcadores característicos de los osteoclastos). Al aplicar reductores probablemente disminuye la actividad o la maduración de estas células.

Abstract We previously, showed that the macrophages fusion induced with Polyethylene glycol (PEG) both of U937/A and J774 lines , led to the differentiation and activation of the osteoclasts according to the expression of the osteoclast markers such as the acid phosphatase resistant to tartrate (TRAP), and the activity of bone resorption, moreover, when submitting the gingival fibr oblasts cells to centrifugal forces, osteoclastic markers were observed as a TRAP presence and resorptive activity. It has been identified that, in order for the differentiation towards the osteoclast to take place, it is necessary to increase the intrace llular concentrations of reactive oxygen species (ROS). At the moment, there is no any experimental model that explains the role of the ROS in osteoclastic differentiation when forces are applied as it’s done in orthodontic treatments. The objective of thi s work was to evaluate the anti - resorptive effect of NAC (N - Acetylcysteine) in cells that are similar to the osteoclasts obtained by fusion with PEG ( polyethylene glycol) or in cells submitted to centrifugal forces. The U937 cells were seeded on sheets of bovine origin cortical bone, and submitted to compressive forces. At the same time, another fraction of cells were fused with polyethylene glicol PEG 1450 and to another one more no treatment was applied; both of them were seeded in similar conditions (con trol group). The groups exposed above, were treated or non treated with 30 m M of the antioxidant drug N - acetyl cysteine (NAC); the TRAP activity, the bone resorptive activity, the presence of actin rings through indirect fluorescence, and the expression o f population markers exclusive to osteoclasts through indirect immunofluorescence were evaluated. The ROS levels were evaluated by means of the DHE ( Hydroethidine) reagent; the cellular fusio n was evaluated through the use of D i D and D i O markers. The difference between the treatment groups was analized by the two - way ANOVA method. A Tukey correlation test was performed to evaluate the degree of correlation between the variables. We found that cellular fusión per se , of U937 cells that are chemically fused with PEG 1450, or the application of compressive force, induce features similar to those of the osteoclasts, such as generating actin rings; increasing the ROS activity; forming positive multinucleated TRAP cells; increasing the expressio n of NF-kB as well as the one of populat ion markers , distinctive of osteoclasts; and increasing th e activity of resorption in sheets of bovine cortical bone. However, resorption and fusion patterns are different when dealing with PEG or submitting to compressive forces. When these experimental groups were treated with 30 m M of NAC, all the effects were reversed, and highly significant differences of P0.001 were observed. Fu sing cells with PEG o submitting them to a centrifuge force, genarates oxidative stress (ROS production) which activates the pathways related to osteoclast maturation (TRAP actin rings, resorption and markers distinctive of osteoclasts ) . When applying redu cers, probably the activity or the maturation of these cells is reduced.