Evaluación de la capacidad inmuno-estimulante de la terapia neo-adyuvante con Doxorrubicina y Ciclofosfamida en pacientes con cáncer de mama

Abstract

La evidencia experimental en modelos de cáncer en animales y estudios clínicos en pacientes con cáncer, sugieren que ciertos regímenes de quimioterapia o radioterapia estimulan el sistema inmune. La Doxorrubicina es un agente quimioterapéutico ampliamente estudiado por su capacidad de inducir muerte celular inmunogénica en células tumorales, un tipo de muerte celular que probablemente favorece la presentación cruzada de antígenos tumorales por células dendríticas (DCs) necesaria para la inmunidad anti tumoral mediada por linfocitos T (LT)-CD8+. Por otra parte, varios informes indican que la Ciclofosfamida utilizada a bajas dosis en pacientes con cáncer reduce el número de LT-CD4+ supresores FoxP3+ (Tregs). A pesar de que el tratamiento con Doxorrubicina y Ciclofosfamida (esquema de quimioterapia A/C) se utiliza ampliamente en nuestro país para el tratamiento neo-adyuvante de pacientes con cáncer de mama, el efecto inmuno-estimulante del tratamiento con A/C en estas pacientes está pendiente de ser demostrado. En un esfuerzo por revelar el efecto inmuno-estimulante de la terapia antitumoral, en esta tesis se implementó un sistema de inmuno-monitoreo de leucocitos de sangre de pacientes con cáncer de mama, que permite establecer correlación entre la respuesta clínica de las pacientes a la quimioterapia con algunos fenotipos funcionales de respuesta inmune celular evaluados in vitro. Para establecer este sistema de inmuno-monitoreo fue necesario optimizar en primer lugar, condiciones in vitro que permitiesen cotejar en sangre periférica de una paciente antes y después de la terapia antitumoral distintas funciones en LT (CD4+ y CD8+) específicos de antígenos tumorales, los cuales se encuentran habitualmente en muy bajo número en sangre de pacientes con cáncer. La etapa de implementación estuvo seguida de la validación de la utilidad del monitoreo de estas funciones celulares en células de un grupo de pacientes con cáncer de mama obtenidas antes y después de tres ciclos de quimioterapia neo-adyuvante con A/C con la capacidad de la terapia antitumoral de restablecer algunas funciones de la respuesta inmune celular. El inmuno-monitoreo de las células de las pacientes con cáncer de mama se realizó en gran medida por el análisis manual de datos de citometría de flujo (CF) multi-paramétrica que permite cuantificar múltiples parámetros y fenotipos celulares en las poblaciones celulares analizadas. Sin embargo, la disponibilidad reciente de nuevos algoritmos bio-informáticos como SPADE, FLOCK, tSNE, y más recientemente CITRUS, que proporcionan nuevas herramientas visuales y estadísticas para el análisis automatizado multidimensional de datos obtenidos por CF los cuales han sido empleados hasta ahora para el análisis jerárquico de la diferenciación de células derivadas de médula ósea y células inmaduras en pacientes con leucemia, fueron utilizados para el análisis multidimensional de las células de las pacientes en muestras antes y después de la quimioterapia tanto ex vivo como en respuesta a un estímulo in vitro. Los resultados de esta tesis muestran que el sistema de inmuno-monitoreo implementado permite evidenciar una asociación entre la respuesta clínica del tumor a la quimioterapia con A/C con una recuperación de la funcionalidad de la respuesta inmune celular en pacientes con cáncer de mama en terapia neo-adyuvante. Consideramos que la restitución de algunas funciones analizadas en LT y DCs en respuesta al tratamiento podrían tener valor predictivo de la respuesta clínica del tumor previo a la aplicación de la quimioterapia neo-adyuvante con A/C. Metodología Para implementar el modelo de inmuno-monitoreo, fue necesario establecer diferentes condiciones de cultivo in vitro que permitiesen evidenciar la funcionalidad de LT y células presentadoras de antígeno (APC) en muestras de sangre periférica obtenidas de donantes sanas como de pacientes con cáncer de mama antes y posterior al tratamiento con tres ciclos de quimioterapia neo-adyuvante con A/C. Inicialmente se optimizó la generación de dos tipos diferentes de DCs maduras derivadas de monocitos en dos días (tipo estándar y tipo alfa), necesarias para activar respuestas Th1, citotóxicas y foliculares. Estas DCs se emplearon en dos sistemas de cultivo in vitro implementados con el fin de evaluar, el primero la respuesta de LT de memoria específicos de antígenos tumorales y el segundo para determinar la presencia de LT específicos de estos antígenos dentro del compartimento de LT vírgenes. Por otra parte, se midieron la frecuencia y estatus inmunológico de dos sub-poblaciones de DCs, de LT-CD4 FoxP3+ reguladores y Células Supresoras de Origen Mieloide (MDSCs) ex vivo y el grado de respuesta al estímulo de LT y de DCs in vitro. Los resultados de CF se analizaron tanto por la estrategia manual (software FlowJo) como con el empleo de algoritmos automatizados como FLOCK, SPADE y CITRUS con el fin de establecer correlación entre los resultados de estos análisis con la respuesta clínica del tumor a la quimioterapia. Resultados La implementación del sistema de inmuno-monitoreo de individuos sanos y de pacientes con cáncer de mama permitió establecer la utilidad como APCs profesionales de dos fenotipos funcionales de DCs derivadas de monocitos en dos días cuyas características fenotípicas y funcionales son indistinguibles de DCs clásicas derivadas en siete días. La evaluación de LT específicos de antígenos en una paciente “modelo” en remisión completa luego de nueve años de tratamiento antitumoral, permitió evidenciar que LT-CD8+ específicos de un antígeno tumoral que infiltraban el tumor al momento del diagnóstico experimentaron un incremento de su frecuencia en sangre varios meses después de la terapia antitumoral. El monitoreo en esta paciente evidenció un fenotipo de inmunosupresión de los componentes APCs y LT. Mientras las APCs mostraron una deficiente respuesta a estímulos pro-inflamatorios y secreción de IL-12p70, los LT respondieron de manera deficiente en respuesta a la estimulación del TCR. De manera notable, estas evidencias de la deficiente respuesta inmune celular en esta paciente se recuperaron de manera significativa luego de la terapia antitumoral. Por su parte el monitoreo de APCs y LT en el grupo de pacientes antes de tres ciclos de quimioterapia neo-adyuvante con A/C reveló las mismas deficiencias funcionales en APCs y LT observadas en la paciente “modelo” previo a la terapia antitumoral. Luego de instaurada la terapia neo-adyuvante con A/C la funcionalidad de estas células alcanzó niveles similares a los observados en las células de mujeres sanas, más aún, en estas pacientes la recuperación de algunos fenotipos funcionales pudo ser correlacionada de manera predictiva con la respuesta clínica del tumor a la quimioterapia con A/C. Finalmente, el análisis automatizado del inmuno-monitoreo con SPADE, FLOCK y CITRUS, permitió confirmar los resultados obtenidos con el análisis manual y además establecer el fenotipo de poblaciones complejas que diferencian el grado de respuesta inmune de personas sanas de muestras obtenidas de pacientes con cáncer de mama. Conclusiones Tomados en conjunto, los resultados obtenidos permiten proponer un modelo de inmuno-monitoreo como herramienta útil para evidenciar en muestras de sangre de pacientes con cáncer de mama la capacidad inmuno-estimulante de la quimioterapia con A/C. Algunos de los parámetros analizados permiten predecir con base en la respuesta funcional del sistema inmune antes de iniciado el tratamiento el grado de respuesta clínica de las pacientes al tratamiento con A/C. Los algoritmos de análisis automatizado son aplicables para los análisis de CF complejos facilitando el procesamiento de múltiples muestras y la identificación de sub-poblaciones celulares que pudiesen ser utilizadas como posibles bio-marcadores característicos del estatus de LT pre-quimioterapia. Este modelo de inmuno-monitoreo actualmente se utiliza para el seguimiento de la respuesta a la vacunación con DCs en el primer ensayo clínico de inmunoterapia fase I/II en nuestro medio en pacientes con cáncer de mama en terapia neo-adyuvante con A/C.

Abstract. Experimental evidence in animal models of cancer and clinical studies in cancer patients suggest that certain chemotherapy or radiotherapy regimens stimulate the immune system. Doxorubicin is a chemotherapeutic agent widely studied for its ability to induce immunogenic cell death in tumor cells, a type of cell death that probably favors cross-presentation of tumor antigens by dendritic cells (DC) required for anti-tumor mediated immunity by T cells CD8+ lymphocytes. On the other hand, several reports indicate that Cyclophosphamide used low doses in cancer patients reduced the number of CD4+ T regulatory cells FoxP3+ (Tregs). Although the treatment with Doxorubicin and Cyclophosphamide (A/C chemotherapy regimen) is widely used in our country for the neoadjuvant treatment of breast cancer patients, the immunostimulating effect of A/C treatment in these patients Is pending. In an effort to reveal the immunostimulating effect of antitumor therapy, this thesis was implemented a system of immuno-monitoring of blood leukocytes of patients with breast cancer, which allows establishing a correlation between the clinical response of the patients to the Chemotherapy with some functional cellular immune response phenotypes evaluated in vitro. In order to develop this immuno-monitoring system, it was necessary to optimize, in the first place, in vitro conditions that allowed to check in a patient's peripheral blood before and after the anti-tumor therapy different functions in T cells (CD4+ and CD8+) specific of tumor antigens, which are usually in very small numbers in the blood of patients with cancer. The implementation phase was followed by validation of the usefulness of the monitoring of these cellular functions in cells of a group of patients with breast cancer obtained before and after three cycles of neoadjuvant chemotherapy with A/C with the capacity of the Antitumor therapy to restore some functions of the cellular immune response. Immuno-monitoring of the cells of patients with breast cancer was performed primarily by manual analysis of multi-parametric flow cytometry (FC) data that allows quantifying multiple cell parameters and phenotypes in the cell populations analyzed. However, the recent availability of new bioinformatics algorithms such as SPADE, FLOCK, tSNE, and more recently CITRUS, provide new visual and statistical tools for the multidimensional automated analysis of FC data that have been used so far for the hierarchical analysis of the differentiation of bone marrow and immature cells derived from leukemia patients were used by us for the multidimensional analysis of patient cells in samples before and after chemotherapy both ex vivo and in response to a stimulus In vitro. The results of this thesis show that the immuno-monitoring system implemented allows to evidence an association between the clinical response of the tumor to the chemotherapy with A/C with a recovery of the functionality of the cellular immune response in patients with breast cancer in therapy Neo-adjuvant. We considered that the restitution of some functions analyzed in T cells and DCs in response to treatment could have a predictive value of the clinical response of the tumor to the application of neoadjuvant chemotherapy with A/C. Methodology To implement the immuno-monitoring model, it was necessary to establish different in vitro culture conditions that would demonstrate the functionality of T cells and antigen-presenting cells (APCs) in peripheral blood samples obtained from healthy donors such as patients with breast cancer before and post-treatment with three cycles of neoadjuvant chemotherapy with A/C. Initially the generation of two different types of mature DCs derived from monocytes in two days (standard type and alpha type), necessary to activate Th1, cytotoxic and follicular responses were optimized. These DCs were used in two in vitro culture systems implemented to initially evaluate the T cell memory response specific to tumor antigens and the second to determine the presence of specific T cells for these antigens within the T naive compartment. On the other hand, we measured the frequency and immunological status of two sub-populations of DCs, regulatory CD4+ FoxP3+ T cells and Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSCs) ex vivo and the degree of response to T and DCs stimulation in vitro. The FC results were analyzed by both manual strategy (FlowJo software) and with the use of automated algorithms such as FLOCK, SPADE, and CITRUS to correlate the results of these analyses with the clinical response of the tumor to chemotherapy. Results The implementation of the immuno-monitoring system of healthy individuals and patients with breast cancer allowed to establish the utility as professional APCs of two functional phenotypes of monocyte-derived DCs in two days whose phenotypic and functional characteristics are indistinguishable from classical DCs derived in seven days. The evaluation of antigen-specific T cell in a model patient in complete remission after nine years of anti-tumor treatment showed that LT-CD8+ specific to a tumor antigen that infiltrated the tumor at the time of diagnosis experienced an increase in its Frequency in blood several months after anti-tumor therapy. Monitoring in this patient evidenced an immunosuppressive phenotype of the APCs and T components. While APCs showed poor response to pro-inflammatory stimuli and secretion of IL-12p70, T responded poorly in response to TCR stimulation. Notably, these evidences of the poor cellular immune response in this patient recovered significantly after anti-tumor therapy. Monitoring of APCs and T in the patient group before three cycles of neoadjuvant chemotherapy with A/C revealed the same functional deficiencies in APCs and T cells observed in the model patient before anti-tumor therapy. After initiation of neoadjuvant therapy with A/C, the functionality of these cells reached levels like those observed in cells of healthy women; moreover, in these patients the recovery of some functional phenotypes could be predictably correlated with Clinical response of the tumor to chemotherapy with A/C. Finally, automated immuno-monitoring with SPADE, FLOCK and CITRUS allowed us to confirm the results obtained with manual analysis and to establish the phenotype of complex populations that differentiate the degree of immune response of healthy individuals from samples obtained from patients with breast cancer. Conclusions Taken together, the results obtained allow us to propose an immuno-monitoring model as a useful tool to evidence the immuno-stimulating capacity of A/C chemotherapy in blood samples from patients with breast cancer. Some of the parameters analyzed allow to predict, based on the functional response of the immune system before treatment, the degree of clinical response of the patients to the A/C treatment. Automated analysis algorithms are applicable for complex FC analyzes facilitating the processing of multiple samples and the identification of cell subpopulations that could be used as a potential biomarkers characteristic of pre-chemotherapy T cell status. This immuno-monitoring model is currently used to monitor the response to DC vaccination in the first clinical phase I/II immunotherapy trial in our setting in patients with neoadjuvant A/C therapy.