Identificación de genes de susceptibilidad en yuca, blancos de TALEs de Xanthomonas axonopodis pv. manihotis

Abstract

La yuca ( Manihot esculenta Crantz) es considerada e l tercer cultivo de mayor importancia en el planeta ya que constituye la principal fuente de calorías para la población de países pobres o en vía de desarrollo. La producción de yuca se ve comprometida por la bacteriosis vascular o CBB (por sus siglas en i nglés: Cassava bacterial blight) causada por la bacteria fitopatógena Xanthomonas axonopodis pv. manihotis ( Xam ) la cual produce perdidas en el cultivo de la yuca que pueden variar entre 12 - 100%. Xam emplea dentro de su arsenal de viruelencia proteinas tip o TALE (por sus siglas en inglés: transcription activator - like effectors) para promover la proliferación bacteriana y la formación de síntomas durante la infección. Los TALEs son translocados al interior de la célula vegetal vía sistema de secreción tipo 3 (SST3) y una vez en el citoplasma son dirigidos al interior del núcleo en donde se unen a secuencias especificas en el ADN de la planta e inducen la expresión de genes que favorecen la patogenicidad de la bacteria. La interacción TALE - ADN es especifica debido a la secuencia codificada en las repeticiones del dominio central del TALE llamadas RVDs (por sus siglas en inglés: Repeat variable diresidues). Tradicionalmente el estudio de la interacción yuca - Xam se ha realizado empleando plantas crecidas a par tir de estacas . Como alternativa, en este trabajo se implementó el sistema de propagación de plantas de yuca in vitro para la obtención de material vegetal . Para esto, p lantas in vitro de 8 semanas de las variedades CM6438 - 14 (resistente) y cv.60444 (susce ptible) fueron inoculadas con diferentes cepas de Xam . La infección bacteriana fue evaluada mediante 1) crecimiento bacteriano a lo largo del tiempo y 2) evaluación de la inducción del gen de susceptibilidad ( S ) MeSWEET10a . Se logró determinar, que al igua l que en plantas adultas, el gen S es inducido tras la infección de Xam en plantas in vitro . De manera paralela se pudo monitorear la proliferación bacteriana a lo largo del tiempo siendo esta mayor en plantas susceptibles que en las resistentes. Se compro bó que el gen S es inducido en plantas susceptibles y no en resistentes y se confirmó igualmente que TALEs de igual número de RVDs pero que difieren en la secuencia tienen como blanco el mismo gen MeSWEET10a. Estos resultados permiten validar el sistema de plantas in vitro como alternativa en el estudio del patosistema yuca - Xam . Una vez validado el sistema de propagación in vitro y con el fin de identificar los genes inducidos en una variedad susceptible de yuca mediados por el repertorio de TALEs de difer entes cepas de Xam, se empleó la estrategia de RNAseq . Fueron empleadas plantas in vitro de la variedad susceptible cv.60444 inoculadas con las Xam 681, Xam 1061, Xam 394 y Xam 3995. Se identificaron los 10 genes más inducidos en cada uno de los tratamientos. Así mismo se determinó mediante herramientas bioinformáticas si en la secuencia promotora de estos genes candidatos existen EBEs para los TALEs, encontrando que los genes Ma nes.05G068700, Manes.13G045100 y Manes.15G026800 pueden ser blancos de más de un TALE y son los que mayor induc ción mostraron y presentan EBEs para los TALEs TALE13 Xam 681 , TALE1 3 Xam 394 , TALE22 Xam 681 y TALE 14 Xa m 1061 . Estos genes corresponden a posibles gene s blanco S que pueden jugar un papel importante en la virulencia de Xam . De esta manera este trabajo representa un importante aporte al conocimiento de los mecanismos de susceptibilidad de la yuca que podrán ser tenidos en cuenta en programas de mejoramie nto para conferir resistencia a diferentes cepas de Xam.

Abstract: Cassava (Manihot esculenta Crantz) is considered the third most important crop on the planet since it is the main source of calories for the population of poor or developing countries. Cassava production is compromised by cassava bacterial blight or CBB caused by the phytopathogeni c bacterium Xanthomonas axonopodis pv. manihotis ( Xam ) which produces losses in the cassava crop that can vary between 12 - 100%. Amog its weapons Xam employs proteins type TALE (transcription activator - like effectors) to promote bacterial proliferation and symptom formation during infection. TALEs are translocated into the plant cell via type 3 secretion system (T3SS) and once in the cytoplasm they are directed into the nucleus where they bind to specific sequences in the plant DNA and induce gene expression promote disease development. The TALE - DNA interaction is specific because of the coded sequence in the TALE central domain repeats called RVDs (Repeat variable diresidues). Traditionally , the study of the cassava - Xam interaction has been carried out using plants grown from stem cuttings. As an alternative, in this work, the propagation system of cassava plants in vitro was used to obtain vegetal material. For this, 8 week - old plants propagated in vitro of the varieties CM6438 - 14 (resistant) and cv.60444 (s usceptible) were inoculated with different strains of Xam . Bacterial infection was evaluated by 1) bacterial growth over time and 2) evaluation of the induction of the susceptibility gene (S) MeSWEET10a . It was determined that, as in adult plants, the S ge ne is induced after Xam infection in plants propagated in vitro . In parallel, it was possible to monitor bacterial proliferation over time, being this higher in susceptible plants than in resistant ones. The S gene was found to be induced in susceptible an d it was also confirmed that TALEs of equal number of RVDs but differing in sequence are targeted to the same MeSWEET10a gene. These results allow ed the validation of the plants propagated in vitro a s an alternative in the study of the cassava - Xam patosystem. Once the in vitro propagation system was validated and in order to identify the genes induced in a cassava susceptible variety mediated by the repertoire of TALEs from different Xam strains, RNAseq strategy was used. In vitro - propagated plant s of the susceptible strain cv.60444 inoculated with the strains Xam 681, Xam 1061, Xam 394 and Xam 395 were used. The 10 most induced genes were identified in each treatment. It was also determined by bioinformatic tools if in the promoter sequence of these c andidate genes there are EBEs (Effector Binding Element) for TALEs, finding that the genes Manes.05G068700, Manes.13G045100 and Manes.15G026800 are the ones that showed the greatest induction and presented EBEs for TALEs TALE13 Xam 681, TALE13 Xam 394, TALE22 X am 681 and TALE14 Xam 1061. These genes correspond to possible susceptib i l ity targets genes that may play an important role in the virulence of Xam . In this way this work represents an important contribution to the mechanisms of susceptibility of cassava that can be taken into account in breeding programs to confer resistance to different strains of Xam.