Senescencia e inflamación en cáncer: Efecto de las citoquinas IL6 e IL8 en la inducción de la transición epitelio-mesenquimal y de CD44 en el desarrollo de funciones stem en células epiteliales tumorales

Abstract

La transición epitelio-mesenquimal (EMT) es un programa celular que ocurre durante la homeostasis de los tejidos, y en condiciones patológicas como el cáncer. En células pre- malignas o malignas, la EMT conlleva a la adquisición de propiedades migratorias e invasivas, y a un fenotipo con funciones de célula stem (o stem-like)1, que se ha asociado con un mayor potencial tumorigénico. Estas células se denominaron como células stem cancerígenas (CSC2), y se han identificado en diversos tipos de cáncer por la expresión de marcadores específicos (CD44, CD133, CD105, ALDH, EpCAM) o por pruebas funcionales. Por otra parte, se sabe que la senescencia celular es un mecanismo de supresión tumoral. Sin embargo, las células tumorales evaden este mecanismo de diferentes maneras y pueden utilizarlo para su crecimiento. En un modelo de células embrionarias de riñón humano (HEK) inmortalizadas, se mostró que estas células eran tumorigénicas únicamente en presencia de fibroblastos senescentes. Se encontró que las células recuperadas o explantadas de estos tumores mostraron un incremento en las propiedades de células stem, esto es capacidad de autorrenovación y de diferenciación multipotente y, sorprendentemente, capacidad autónoma para formar tumores. Igualmente, un medio condicionado de fibroblastos senescentes (MeCoSe) indujo en estas células plasticidad epitelial (fenotipo híbrido con marcadores epiteliales y mesenquimales, con expresión elevada de CD44 y variable de CD24) y adquisición de propiedades de células stem, sugiriendo que los factores solubles serían responsables de estas adquisiciones funcionales. La caracterización del MeCoSe mostró que estaba enriquecido principalmente en las citoquinas pro-inflamatorias IL6 e IL8. En la línea celular MCF-7 de cáncer de seno tipo luminal, clasificada como poco agresiva, mostramos que IL6 e IL8 indujeron la EMT, funciones de células stem (autorrenovación y capacidad de diferenciación multipotente) y una mayor migración e invasión, es decir, células con un fenotipo mucho más agresivo. De esta manera, se mostró que células no tan agresivas o pre- malignas pueden adquirir un fenotipo más tumorigénico cuando se encuentran en un microambiente senescente. La utilización de anticuerpos neutralizantes para IL6 e IL8 y la 1 Stem-like para denotar células que presentan un fenotipo y funciones similares a la de células madre normales o referidas aquí como stem. 2 Células denominadas también como células stem tumorales, o células iniciadoras de tumor (TIC, por sus siglas en inglés) y referidas aquí como CSC. Son células que además de presentar características de células stem, presentan una alta capacidad de formar tumores. 15 activación de la vía de señalización de Jak/Stat3 confirmaron la relevancia de estas citoquinas en estos procesos. La población de células enriquecidas en el marcador CD44 mostró una mayor adhesión y migración, pero no una mayor capacidad de autorrenovación. Por otra parte, mostramos una relación importante entre la senescencia y la inflamación, y de manera muy relevante, que existen mecanismos celulares de retroalimentación recíproca, con células senescentes que producen citoquinas inflamatorias, las cuales a su vez inducen más senescencia y secreción adicional de citoquinas inflamatorias que perpetúan el estímulo y la aparición de CSC. Se evaluó también el papel de IL6 e IL8 en una línea celular del subtipo basal/mesenquimal, claudina bajo (MDA-MB-231), con fenotipo EMT y por ende propiedades stem, que secreta IL6 e IL8 de manera constitutiva y además, es más agresiva. La neutralización de las citoquinas disminuyó la capacidad de migración de células MDA- MB-231, pero no tuvo un efecto mayor sobre sus propiedades stem. No obstante, estas células presentaron funciones de células stem incompletas, es decir, una menor capacidad de autorrenovación y una diferenciación multipotente anormal. Estos experimentos muestran que un fenotipo tumoral puede ser modulado mayormente por el microambiente tumoral y sugieren que si bien la capacidad tumorigénica se asocia de manera general con propiedades de células stem, esta puede darse en contexto de unas funciones stem no tan robustas, siempre y cuando el contexto celular (presencia de ciertas capacidades funcionales) las complemente de manera adecuada. Para evaluar mejor la relación entre tumorigenicidad y la presencia o adquisición de funciones de células stem, se utilizó nuevamente el modelo de células HEK explantadas. La selección de dos subpoblaciones de la línea celular explantada PC1-Expl-1, con base en la expresión del marcador CD24, mostró que a pesar de que las células CD44+CD24Pos presentaron un fenotipo EMT, una mayor migración e invasión, y un enriquecimiento en propiedades de células stem, fueron incapaces de formar tumores. Por el contrario, las células CD44+CD24Neg formaron tumores de manera muy eficiente, muy similar a las células parentales (PC1-Expl-1). Al igual que lo que señalamos arriba para la línea de cáncer de seno MDA-MB-231, las células CD44+CD24Neg mostraron funciones de células stem menos robustas, pero mayor capacidad de adhesión, de proliferación celular y de formación de colonias, revelando que otras características funcionales adicionales pueden ser determinantes en el potencial tumorigénico y que éstas dependerían de las funciones de células stem que presenten las células malignas en un momento determinado del desarrollo 16 tumoral. En otras palabras, los resultados obtenidos en estos modelos sugieren que un estado stem (en inglés, stemness3) completo no es indispensable para la tumorigenicidad, y que la agresividad tumoral puede deberse a otras características celulares que complementan las funciones de células stem presentes en la célula tumoral. Si la tumorigenicidad resulta ser dependiente de ciertas características de células stem que se manifiestan en conjunto en un contexto celular particular y en una etapa determinada del desarrollo tumoral, su definición sería de relevancia para el desarrollo de nuevos blancos terapéuticos.

The epithelial mesenchymal transition (EMT) is a cellular program present during tissue homeostasis and in pathological conditions such as cancer. In premalignant and malignant cells, the EMT is often accompanied by the acquisition of migratory and invasive properties, and the generation of cells with a phenotype similar in function to stem cells (stem-like)4 , associated with an increase in tumorigenic potential. These cells are called cancer stem cells (CSC)5 , and they have been identified in various types of cancer by the expression of specific markers (CD44, CD133, CD105, ALDH, EpCAM) or by functional assays. On the other hand, Cellular senescence is a tumour-suppressive mechanism. However, the tumour cells evade this mechanism in different ways and can use it for their own growth. In an immortalized Human embryonic kidney cells (HEK) model, it was previously shown that these cells have the potential to become fully tumorigenic exclusively in the presence of senescent fibroblasts. Cells recovered from senescence-promoted tumors or explanted cells exhibited enhanced stem-like cell properties, including self-renewal and multilineage differentiation capacity and surprisingly high cell-autonomous tumorigenicity. Likewise a senescent-conditioned medium of senescent fibroblasts (MeCoSe) induced epithelial cell plasticity (hybrid phenotype with epithelial and mesenchymal markers, high expression of CD44 and variable expression of CD24) and the acquisition of stem cell properties, suggesting that soluble factors would be responsible for the acquisition of these functional properties. The characterization of MeCoSe showed an enrichment mainly in the proinflammatory cytokines IL6 and IL8. In MCF-7, a luminal type breast cancer cell line, classified as not very aggressive, we showed that IL6 and IL8 induced the EMT, functions of stem cells (self-renewal and multipotent differentiation capacity) and higher migration and invasive capacities, that is, cells with a more aggressive phenotype. Thereby, it was shown that less aggressive or pre-malignant cells in the presence of senescent microenvironment can acquire a more tumorigenic phenotype. Indeed, neutralizing antibodies against IL6 and IL8 and the activation of Jak/Stat3 signaling pathway reaffirm the relevance of these cytokines in these processes. The population of cells enriched in the CD44 marker showed a greater adherence and migration capacity, but not a greater self-renewal capacity. Furthermore, we show an important relationship between senescence and inflammation, and very importantly, that there exists a cellular mechanism by which senescence and inflammation are reinforced with senescent cells that produce inflammatory cytokines which in turn induce more senescence and the additional secretion of inflammatory cytokines that perpetuate the stimulus and the appearance of CSC. We also evaluated the role of IL6 and IL8 in a basal/mesenchymal breast cancer cell line (MDA-MB-231), with an EMT phenotype and therefore stem properties, which secretes constitutively IL6 and IL8 and is also more aggressive. The neutralization of the cytokines decreased the migration capacity of MDA-MB-231 cells but did not have a significant effect on their stem properties. Nevertheless, these cells exhibited incomplete stem cell functions, that is, a lower self-renewal capacity and an abnormal multipotent differentiation.These experiments show that a tumour phenotype can be modulated mainly by the tumour microenvironment and suggest that although the tumorigenic capacity is generally associated with stem cell properties, this can occur in the context of not so robust stem functions, as long as the cellular context (presence of certain functional capacities) complements them adequately.To better assess the relationship between tumorigenicity and the presence or acquisition of stem cell functions, the HEK-derived explanted cells model was used again. The selection of two subpopulations from PC1-Expl-1 explanted cell line, according to the expression if CD24 cell marker, showed that although the CD44+CD24Pos cells exhibited an EMT phenotype, a higher migration and invasion capacities, and an enrichment in stem cell properties, were unable to form tumors. On the contrary, the CD44+CD24Neg cell subpopulation was totally competent to induce tumour formation as efficiently as the parental cell line (PC1-Expl-1). Similarly to what was previously indicated for the breast cancer cell line MDA-MB-231, CD44+CD24Neg cell subpopulation showed less robust stem cell functions, but high adhesion, proliferation and clonogenic capacity, revealing that other additional functional characteristics can be determinant in the tumorigenic potential and that these would rely on the stem cell functions that malignant cells have at certain moments of tumor development. In other words, the results obtained in these models suggest that a complete state of stem cells (stemness)6 is not indispensable for tumorigenicity, and that the tumor aggressiveness may be due to other cellular characteristics that complement the functions of stem cells present in the tumor cell. If tumorigenicity turns out to be dependent on certain characteristics of stem cells that are manifested together in a particular cellular context and at a certain stage of tumor development, its definition would be relevant for the development of new therapeutic targets.