Actinobacterias marinas como fuente de compuestos con actividad biológica para el control de fitopatógenos

Abstract

La agricultura a nivel mundial enfrenta dificultades por la presencia de gran cantidad de fitopatógenos, condición a la cual no es ajeno nuestro país. La forma tradicional de enfrentar esta problemática ha sido con el uso de plaguicidas de origen sintético aplicados extensamente en diversos cultivos. Los plaguicidas sintéticos presentan efectos nocivos a nivel toxicológico y favorecen el surgimiento de cepas resistentes a estos tratamientos. Una de las alternativas para reemplazar estos plaguicidas, es el uso de microorganismos que puedan actuar o bien como productores de metabolitos secundarios activos, o que puedan actuar como agentes de biocontrol de los fitopatógenos. Buscando aportar al conocimiento de la diversidad metabólica ofrecida por los microorganismos marinos, en particular por las actinobacterias, una temática relativamente nueva a nivel mundial y muy poco explorada en Colombia, se presenta en esta tesis doctoral la obtención de una colección de actinobacterias aisladas de ambientes marinos del Caribe colombiano y la exploración de su potencial como fuente de compuestos para el control de fitopatógenos. Como un primer resultado, se logró la obtención de una colección de 203 microorganismos aislados de muestras recolectadas en ambientes marinos. Esta colección representa una de las pocas colecciones especializada en microorganismos de estos ambientes que hay en el país, la cual contribuye a la caracterización de la microbiota colombiana. Los resultados de la caracterización de la colección de microorganismos permitieron identificar 24 aislamientos pertenecientes al Phylum Actinobacteria, los cuales fueron caracterizados por pruebas bioquímicas, morfológicas, por la caracterización de la producción de ácidos diaminopimélicos, la secuenciación del gen 16S rRNA y por el perfil proteico obtenido por MALDI-TOF. Los resultados indicaron que los 24 aislamientos se encuentran filogenéticamente relacionados al Phylum Actinobacteria y están representados por los géneros Streptomyces (22 aislamientos), Gordonia (un aislamiento, PNM-25) y Micromonospora (un aislamiento, PNM-102N). Los extractos orgánicos y acuosos de la colección fueron evaluados como fuente de compuestos con actividad antibacteriana y antifúngica frente a las bacterias Burkholderia plantarii ATCC 43733, Burkholderia glumae ATCC 33617 y Burkholderia gladioli CIAT 3704-1 (patógenas del cultivo del arróz), frente a los hongos Fusarium oxysporum f.sp. dianthi raza 2 (patógeno de clavel) y Colletotrichum gloeosporioides 26B (patógeno del ñame). Así, se logró identificar aislamientos con actividad de amplio espectro, algunos extractos como el obtenido de Streptomyces sp. PNM-161a logró controlar a 3 de los 5 patógenos evaluados, y extractos como el obtenido de Streptomyces sp. PNM-5, mostró una alta especificidad por el control de solo uno de los fitopatógenos evaluados. El perfilado metabólico de los 24 aislamientos de actinobacterias empleando HCA, OPLS-DA y la estrategia del barcoding permitió evalular la diversidad metabólica de los extractos orgánicos, encontrando aislamientos de alta diversidad metabólica como Streptomyces sp PNM-208, a la vez que se encontraron aislamientos como Streptomyces sp. PNM-9, de baja diversidad química. Se realizó una propuesta de integración de la información metabólica, taxonómica y de actividad biológica, la cual, en conjunto con los procesos de derreplicación, nos permitió generar criterios de selección de algunos de los aislamientos (Streptomyces sp. PNM-161a, Streptomyces sp. PNM-208, Streptomyces sp. PNM-9, Streptomyces sp. PNM-182 y Streptomyces sp. PNM-5), para realizar la búsqueda de compuestos para el control de fitopatógenos. Con esta información, se abordó el estudio de los compuestos producidos por tres de ellas Streptomyces sp. PNM-9, Streptomyces sp. PNM-161a, Streptomyces sp. PNM-208. El estudio del extracto orgánico de Streptomyces sp. PNM-161a, aislamiento recuperado de una muestra de Bryopsis sp., permitió el aislamiento y la identificación de dos tetrapéptidos cíclicos identificados como ciclo-[L-Phe-L-Pro-L-Leu-L-Pro] 5.1 y ciclo-[L-Phe-L-Pro-L-Ile-L-Pro] 5.2, junto con 5 dicetopiperazinas (DKPs). La estructura de los compuestos fue elucidada por RMN mono y bidimensional, MS y por comparación con los datos reportados en literatura. La configuración absoluta de los tetrapéptidos se determinó mediante el método de Marfey. La evaluación de la actividad para el control de los fitopatógenos mostró que los compuestos más activos fueron el péptido 5.1 (B. gladioli MIC = 0.068 mM; B. glumae MIC = 1.1 mM) y la dicetopiperazina ciclo-[L-Pro-L-Leu] compuesto 5.5 (B. gladioli MIC = 0.3 mM; B. glumae MIC = 2.4 mM), además de otros compuestos con actividad moderada. Los compuestos 5.1 y 5.2 mostraron inhibir la germinación de los conidios de Colletotrichum gloeosporioides en un 65% y un 50% respectivamente, lo cual permitió identificar a estos tetrapéptidos como los compuestos responsables de la actividad observada en el extracto crudo de Streptomyces sp. PNM-161a. El estudio químico del extracto orgánico de Streptomyces sp. PNM-208, aislamiento recuperado de una muestra del octocoral Eunicea fusca, permitió el aislamiento e identificación de seis antimicinas identificadas como la urauchimicina A (6.1), urauchimicina C (6.2), deisovaleril blastmicina (6.3), antimicina A6a (6.4), antimicina A5a (6.5a), antimicina A5b (6.5b) y dos dicetopiperazinas, la brevinamida F (6.6) y la ciclo-[L-Phe-L-Pro] (6.7). La estructura de los compuestos fue elucidada por RMN mono y bidimensional, MS y por comparación con los datos reportados en literatura. Como resultado de la evaluación de la actividad antifúngica se encontró que todas las antimicinas, excepto 6.2 mostraron actividad inhibitoria de la germinación de conidios del hongo fitopatógeno C. gloeosporioides con un porcentaje de germinación entre 0 y 4 %. Las dos DKP evaluadas no mostraron inhibir la germinación de conidios. Este ensayo permitió determinar que las antimicinas son los compuestos responsables de la actividad observada en el extracto de Streptomyces sp PNM-208. El perfilado metabólico por RMN de la cepa Streptomyces sp. PNM-9, recuperada de una muestra de algas del género Dictyota, permitió correlacionar su actividad biológica contra los fitopatógenos del arroz B. glumae y B. gladioli con su producción metabólica a través de herramientas de análisis multivariado. Los compuestos 2-metil-N-(2'-feniletil)-butanamida (7.1) y la 3-metil-N-(2'-feniletil)-butanamida (7.2), fueron identificados a partir del extracto en medio TSB y LB a los 15 días de cultivo a través de experimentos monodimensionales de RMN. Estos compuestos fueron posteriormente aislados de Streptomyces sp. PNM-9 en medio TSB y sus estructuras fueron confirmadas con los datos de RMN 1D, 2D y MS. Estos dos compuestos, presentaron una MIC de 2.43 mM y 1.21 mM, respectivamente. Esta investigación representa una primera aproximación para establecer el potencial biotecnológico de la colección de actinobacterias aisladas de ambientes marinos para su uso en el control de fitopatógenos, contribuyendo además con la caracterización de la diversidad química de algunos de los aislamientos mas promisorios, cuyos compuestos pueden ser usados para el control de fitopatógenos.

Abstract: Agriculture is currently being challenged by the presence of massive quantities of phytopathogens, an issue that represents also a concern to our country. Spreading synthetic pesticides on crops represent a traditional way of controlling phytopathogens, compounds that often exhibit toxic effects and promote the rising of resistant strains. An alternative to replace such products are microorganisms, they constitute an interesting strategy to combat phytopathogens because they either produce bioactive secondary metabolites or behave as biocontrol agents. This work was aimed to contribute to the chemical study of the metabolic diversity of microorganisms from marine sources, particularly actinobacteria. This research field is recognized worldwide as young and promising, and has not been extensively explored in Colombia. Hence, in this doctoral dissertation is presented the isolation of a collection of actinobacteria strains from marine environments located at the Caribbean Sea, and its potential as a source of compounds for phytopathogens control. First of all, starting from samples taken out from marine environments, a collection of 203 microorganisms was obtained and isolated, becoming into one of the main collections of microorganisms in our country, which largely contributes to the characterization of Colombian marine diversity. Taxonomical classification of these microorganisms allowed us to identify 24 strains belonging to the Actinobacteria phylum. They were classified through biochemical tests, morphology, characterization of their diaminopimelic acids production, 16S rRNA gene sequencing and from the protein profile which was obtained by MALDI-TOF patterns. These 24 isolated Actinobacteria strains were distributed in Streptomyces (22 isolated strains), Gordonia (1 isolated strain, PNM-25) and Micromonospora (1 isolated strain, PNM-102N). The organic and aqueous extracts from the collection were evaluated as a source of antibacterial and antifungal compounds, particularly against the bacteria Burkholderia plantarii ATCC 43733, Burkholderia glumae ATCC 33617 and Burkholderia gladioli CIAT 3704- 1 (rice pathogens), or against the fungi Fusarium oxysporum f.sp. dianthi race 2 (Carnation pathogen) and Colletotrichum gloeosporioides 26B (Yam phatogen). The extracts from some isolated strains showed a remarkable bioactivity, for instance, Streptomyces sp. PNM-161a controlled 3 out of 5 pathogens. Furthermore, other extracts such as those obtained from Streptomyces sp. PNM-5 showed a higher specificity at controlling only one of the evaluated phytopathogens. The organic extracts from the 24 isolated strains were analyzed through metabolic profiling employing HCA and OPLS-DA along with a barcoding strategy. Assessment of metabolic diversity in the extracts revealed some cases of isolated strains with high metabolic diversity and chemical profiles which are completely differentiated from other isolated strains such as those obtained from Streptomyces sp PNM208. Other isolated strains such as Streptomyces sp PNM-9 showed a low chemical diversity with a metabolic profile which is similar to its culture media. An integral proposal comprising metabolomic information, taxonomy, biological activity and dereplication strategies, was constructed to select some of the strains (Streptomyces sp. PNM161a, Streptomyces sp. PNM-208, Streptomyces sp. PNM-9, Streptomyces sp. PNM-182 and Streptomyces sp. PNM-5), to perform their study as sources of compounds for phytopathogen control.