Estudio de bioprospección de compuestos inhibidores de la comunicación celular (QS) como estrategia de control de agentes fitopatógenos

Abstract

En esta tesis el aislamiento se hizo de manera bioguiada usando el biosensor Chromobacterium violaceum ATCC 31532. Los compuestos puros identificados también se evaluaron como inhibidores del QS (IQS) frente a Burkholderia glumae CIAT 4026, aislada de cultivos de arroz en Colombia, causante del añublo bacterial de la panícula de arroz. Algunos fenotipos de virulencia controlados por QS en B. glumae son la producción de toxoflavina y motilidad swimming\ Para evaluar el potencial metabólico de los microorganismos procedentes del Mar Caribe colombiano, se recolectaron muestras de invertebrados, algas, peces y sedimentos marinos. Se aislaron 203 microorganismos. Entre ellos 162 se describieron como bacterias, y 41 como hongos. El estudio empezó con bacterias del Phylum Actinobacteria (géneros Streptomyces, Micromonospora y Gordonia), reconocido como una fuente de compuestos con actividad biológica. Se identificaron 24 Actinobacterias, de las cuales 8 resultaron activas como IQS. Los extractos orgánicos fueron analizados por HPLC-MS, con esta información se llevó a cabo un estudio metabolómico que permitió relacionar las variables que describen al sistema con los valores de actividad biológica. Estos resultados permitieron identificar preliminarmente algunos compuestos activos como la streptomicina D. Finalmente se plantea una discusión sobre qué información usar (actividad biológica, perfil por LC-MS, información taxonómica) para la priorización de las cepas a estudiar, planteando un enfoque integrador y los posibles resultados de esta estrategia. Se eligieron dos cepas para realizar estudios químicos preliminares: Micromonospora sp. PNM102N, y Steptomyces sp. PNM89.3 por ser las que presentaban buena actividad biológica. De estas cepas se aisló compuestos lipídicos como los responsables de la actividad. No se continuó con el estudio químico de estos compuestos porque se recuperan en muy baja cantidad y su actividad no es muy fuerte. De los 138 aislamientos que no pertenecen al Phylum Actinobacteria se idenficaron 8 cepas activas. Estas fueron caracterizadas bioquímicamente e identificadas molecularmente correspondiendo a los géneros: Bacillus, Paenibacillus, Lisynibacillus y Proteus. Una no pudo ser caracterizada molecularmente. Para el estudio químico se seleccionó a la cepa PNM115 (Paenibacillus sp), por ser la más activa y presentar su actividad en la fase butanólica. Un estudio detallado de los espectros mono y bi dimensionales llevaron a caracterizarlo como un péptido análogo de las polimixinas con unidades Val-Ser, Asn-Phe, ácido léucico, leucina, isoleucina, dos unidades de cisteína y una de ácido 3-hidroxi-4-metilhexanoico, y una masa de 1119.7135. Además, se buscó determinar si los compuestos volátiles (COVs) producidos por los aislamientos eran los responsables de la actividad IQS. Para esto las 16 cepas fueron evaluadas en un ensayo que asegura que el contacto a través del espacio de cabeza. Se encontró que sólo, la cepa PNM216 mostró actividad, ésta aún no ha sido identificada molecularmente. Del estudio por SPME y CG-EM se identificaron 29 compuestos diferentes a los producidos por el medio de cultivo. De éstos, 13 se ensayaron frente al biosensor. Así se logró establecer que cuatro compuestos: p-cimeno, el cumeno, el 5-metil-2-hexanona y la 2-nonanona eran activos inhibiendo la violaceina. Para determinar la efectividad de los compuestos como IQS se hicieron curvas de crecimiento en el que se encontró que tres parecían actuar como bacteriostáticos y el compuesto 5-metil-2-hexanona no afectaba el crecimiento, por lo tanto, es QQ. Se evaluaron otros compuestos volátiles, no identificados en el espacio de cabeza de la bacteria, entre estos fueron activos el acetato de isoamilo y el alcohol isoamílico. El estudio se continuó con la exploración de otras fuentes como esponjas del orden Haplosclerida, recolectadas en el Caribe colombiano. Se recolectaron cinco esponjas de los géneros Haliclona y Amphimedon. De estas únicamente Amphimedon viridis demostró actividad en la fracción butanólica de la cual se aisló el complejo halitoxina. De la fracción WW, también activa, se aisló la taurina. Finalmente, se estudiaron 7 especies de plantas del subgénero Tacosnia y una del subgénero Passiflora (Passifloraceae) Se realizó el perfilado metabolómico, por RMN 1H, lográndose detectar 53 compuestos de diferente naturaleza química. Los datos de RMN-1H para los extractos fueron correlacionados con su actividad QQ mediante un análisis supervisado OPLS-DA, identificando que los compuestos responsables de la actividad eran los flavonoides de P. lehmannii y P. uribei, que además son nuevos. Para evaluar la efectividad in vivo de los compuestos, se usó un modelo con catáfilos de cebolla infectados con el fitopatógeno del arroz B. glumae. Este modelo permite predecir los resultados a obtener con semillas de arroz.

Abstract: Quorum sensing (QS) is a bacterial cell-cell communication process, which allow s the regulation of gene expression in response to fluctuations in cell-population density. It is recognized that the quorum sensing inhibition can lead to prevent bacteria expression of virulence factors, essential for pathogen colonization or disease development along their interaction with the host. Therefore, the aim of this study was to contribute to control bacterial phytopathogens through the exploration of natural products as quorum sensing inhibitors. The role of quorum quenchers (QQ) to control bacterial phytopathogens has been poorly, it has become necessary to search for compounds with quorum quenching activity. In this study, screening of QS inhibitors were performed over several natural sources such as bacteria, sponges and plants. This guaranteed a wide exploration of the chemical space, including compounds of low and high polarity, volatiles and nonvolatiles