Evaluación de la expresión y fosforilación de c Src, Syk y el re-arreglo de actina asociados con la actividad resortiva de CMNSP fusionadas con polietilenglicol

Abstract

Los estudios en resorción ósea son numerosos, ofreciendo diversos modelos para la obtención in vitro de células similares a osteoclastos con actividad resortiva. Usando un nuevo modelo, barato y de corto tiempo de realización, basado en la fusión celular, se evaluó la expresión de Syk, c-Src, el arreglo de la actina y la actividad resortiva de las CMNSP fusionadas con PEG. Primero, en estas CMNSP sembradas en láminas de hueso cortical, por 1, 7 a 14 días, usando un anticuerpo monoclonal anti actina y uno anti-ratón conjugado a FITC o “rhodamine”, se observó un arreglo de actina, similar a podosomas, cinturones de actina y zonas de sellado; además, se extienden sobre superficies como vitronectina, colágeno tipo I y SFB. Por citoquímica, usando pararrosalinilina hexazotizada y α- naftol fosfato, se observó que formaban células multinucleares con actividad TRAP. La evaluación de la morfología nuclear con Hoechst o DAPI, mostró un fenotipo policarión. Cuando, estas células fueron lisadas, usando NaOCl al 6%, 5.2% de NaCl y las láminas se colorearon con Commassie, se determinó que tenían una alta actividad resortiva. Por microscopia de fluorescencia, utilizando anticuerpos policlonales, estas células con PEG expresaron CD13, RANK, anhidrasa carbónica II, ATPasa vacuolar VI, receptor de calcitonina, catepsina K e integrina αvβ3; por microscopía de barrido o SEM, estas células presentaron extensiones de membrana de adherencia como filipodios y bordes en cepillo. Por último, con inmunoblot y co-inmunoprecipitación, se asoció la expresión, fosforilación de Syk, así como de c-Src con la adherencia y resorción ósea. / Abstract. Studies in bone resorption are numerous, offering different models to obtain in vitro osteoclasts like cells with resorptive activity. Using a new model, cheap and short time of realization, based on cell fusion, we evaluated the expression of Syk, c-Src, the arrangement of actin and resorptive activity of CMNSP fused with PEG. First, in these CMNSP harvest on cortical bone slices for 1, 7 or 14 days, using a anti-actin monoclonal antibody and an anti-mouse conjugated to FITC or rhodamine, observed an arrangement of actin, similar to podosome, actin belts and sealing zone, also spread on surfaces such as vitronectin, collagen type I and FBS. For cytochemystry, using hexazo-tised pararosalinine and α-naphthol AS B1 phosphate showed that formed multinucleated cells with TRAP activity. Evaluation of nuclear morphology with Hoechst or DAPI showed a phenotype policarion. When cells were founding to have high resortive activity. For fluorescence microscopy, using polyclonals antibodies, these cells with PEG expressed CD13, RANK, carbonic anhydrase II, vacuolar type H+ - ATPase, calcitonin receptor, cathepsine k and integrin αvβ3; by scanning electron microscopy or SEM, the cells showed membrane extensions adherence as filipodiums and ruffled. Finally, immunoblot and co-immunoprecipitation, was associated with the expression, phosphorylation of Syk and c-Src to the adhesión and bone resorption.