Estudio de la función y efecto de la apolipoproteína E y sus receptores en la diferenciación y balance muerte/supervivencia en un modelo neuronal

Abstract

Entidades tales como la enfermedad de Parkinson (EP) y enfermedad de Alzheimer (EA) constituyen las dos primeras patologías degenerativas del Sistema Nervioso Central en frecuencia, y por tanto se posicionan como un constante de la consulta especializada de Neurología. En los últimos años se han realizado esfuerzos para determinar los factores tanto genéticos como ambientales que pueden llevar al estado patológico. Asimismo, los trastornos del desarrollo del sistema nervioso central son un constante en la clínica. Ambos grupos de patologías al parecer confluyen en una vía común que está muy relacionada con la señalización dependiente de los lípidos, que incluyen la inducción de la muerte por el esfingolípido ceramida, un producto del metabolismo de lípidos de membrana y las alteraciones generadas por los diferentes alelos de la Apolipoproteína E (APOE). Se conoce bien que la presencia del Alelo E4 de la APOE genera un riesgo elevado de padecer EA, aunque la fisiopatología y las vías moleculares implicadas en este proceso de muerte neuronal facilitada, permanecen desconocidas. El objetivo general de este proyecto es contribuir al esclarecimiento del papel de la proteína APOE y sus receptores en el balance muerte/supervivencia celular, así como su rol en la diferenciación, estudiando sus efectos en un modelo celular neuronal. Inicialmente se decidió caracterizar ciertos aspectos de la diferenciación de las células como el nivel de expresión de algunos receptores de APOE y como se correlaciona esta expresión con la generación de árboles dendríticos. Se usaron dos líneas celulares: Células CAD (Mesencefálicas, Murinas) y SH-SY5Y (Neuroblastoma, Humanas). En estudios previos se ha determinado que la diferenciación total de las células CAD se alcanza al cuarto día de cultivo en las condiciones apropiadas. Los análisis de Western Blot determinaron que el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR) se expresa en células CAD diferenciadas y no diferenciadas, mas no en células SH-SY5Y. Además, la expresión de dicho receptor en células CAD aumenta con respecto a la diferenciación, alcanzando una expresión 2.5 veces superior comparada con el control indiferenciado. De manera contraria, el Receptor de Apolipoproteína E 2 (APOER2) y el Receptor de Lipoproteínas de Muy Baja Densidad (VLDLR) no parecen expresarse en estas líneas celulares. Estos datos fueron confirmados mediante inmunofluorescencia. Se observa la clara expresión de LDLR en células CAD diferenciadas e indiferenciadas mas no se observa fluorescencia para las proteínas APOER2 y VLDLR. Se realizó un análisis morfométrico de las células CAD durante los cuatro días de diferenciación que incluyó tres variables: longitud dendrítica promedio, promedio del número de procesos primarios y promedio de procesos totales. La medición neuronal se realizó usando el Software Neuronmetrics, que permite analizar la longitud y arborización dendrítica de varias neuronas a la vez de manera semi-automática. Posteriormente, se analizó el efecto de las diferentes isoformas de la APOE sobre las células CAD. Usando un marcador de actividad mitocondrial como el ensayo MTT se determinó que la exposición de las células CAD a una dosis de 10 ug/ml de APOE E3 y E4 aumenta el metabolismo mitocondrial de este sustrato hasta en un 50% a las 48 horas de tratamiento. Por el contrario, la exposición a APOE E2 reduce la actividad mitocondrial entre un 40 y 50%. Estos efectos no fueron observados en células SH-SY5Y, probablemente debido a la ausencia del receptor. Para confirmar si este fenómeno era explicado por muerte celular o división celular, se realizó la medición de la liberación de Lactato Deshidrogenasa (LDH) al medio de cultivo. No se encontraron diferencias significativas en esta prueba cuando se compararon los valores entre tratamientos con las variantes de APOE o el control, lo que excluye la muerte o la división celular como un evento que explique las diferencias en el metabolismo del MTT. Otro de los objetivos era determinar qué efecto tendrían las diferentes isoformas de APOE en un contexto neurotóxico. Para esto, las células fueron expuestas a las isoformas de APOE en las condiciones arriba mencionadas, y adicionalmente fueron tratadas con C2-ceramida, un lípido ampliamente conocido por generar apoptosis en ambas líneas celulares. El pretratamiento con la isoforma APOE E2 al parecer ejerce un leve efecto protector contra la C2-ceramida en células CAD, el cual no está presente cuando se usan las isoformas E3 y E4. No se observó ninguna protección o muerte adicional en células SH-SY5Y con ninguna de las isoformas. Por último, se realizó una medición de la activación de la vía PI3K/Akt tomando como indicador la fosforilación de la proteína AKT en el residuo Ser473 cuando las células se exponían a las diferentes isoformas de APOE. Dicho experimento reveló una sobre-activación de la vía cuando se tratan las células con APOE E4, y de manera contraria, se reduce la activación cuando el tratamiento se realiza con APOE2; resultados que se correlacionan con lo observado en los ensayos de MTT. Como conclusión, observamos que las isoformas de APOE tienen un efecto diferencial sobre la mitocondria a corto plazo. Este efecto es coincidente y se correlaciona con la activación de la vía PI3K/Akt. El entendimiento de la fisiología de las isoformas de APOE podría usarse con fines terapéuticos contra enfermedades neurodegenerativas. / Abstract. Diseases such as Parkinson’s diseases (PD) and Alzheimer’s disease are the top two degenerative pathologies of the central nervous system, so they figure as constant consultation in the specialized neurological services. In the last years, a lot of efforts have been focused in determining the genetic and environmental factors that could lead to the pathologic state. Developmental disorders of the central nervous system are also constant cause of consultation in the clinic. Both groups of disorders seem to converge in a common pathway that is closely related to the lipid-dependent signaling, that includes neuronal death induced by the sphingolipid Ceramide, a product of the metabolism of membrane lipids and the alterations generated by the different alleles of the Apolipoprotein E (APOE). Is well known that the presence of the allele E4 of the APOE is a high risk factor for EA, although the pathophysiology and the molecular pathways involved in this process and in particular how it facilitates neuronal death remains unclear. The general objective of this project is to clarify the role of the APOE and its receptors in the neuronal death/survival balance and its function in neuronal differentiation in two neuronal cell models. Initially, we decided to characterize certain aspects of the differentiation of the cells, as the level of expression of some APOE receptors and the correlation of their expression with the generation of dendritic trees. Two cell lines were used: CAD cells (Mesencephalic, Murine) and SH-SY5Y cells (Neuroblastoma, Human). Previous studies have determined that the total differentiation of CAD cells is reached at day fourth of culture in the appropriate conditions. Western blot analyses determined that Low-Density Lipoprotein Receptor (LDLR) is expressed in differentiated and undifferentiated CAD cells, but is not expressed in SH-SY5Y cells. In addition, the expression of LDLR in CAD cells increases along with the differentiation process, reaching a 2.5 fold expression compared with undifferentiated control. Conversely, the Apolipoprotein E Receptor 2 (APOER2) and Very Low-Density Lipoprotein Receptor (VLDLR) seem to be not expressed in both cell lines. These data were confirmed using immunofluorescence. Clear expression of LDLR is observed in differentiated and undifferentiated CAD cells, but no fluorescence is observed for the APOER2 and VLDLR proteins. A morphometric analysis of the CAD cells along the four days of differentiation was performed and included three variables: average of dendritic length, average of the number of primary processes and average of number of total processes. The neuronal measurement was performed using Neuronmetrics Software that allows the analysis of length and dendritic branching of several neurons at the same time in a semi-automatic fashion. The effect of the different APOE isoforms on the CAD cells was analyzed. Using a mitochondrial activity marker such as the MTT assay we determined that the exposure of CAD cells to 10 ug/mL dose of APOE E3 and E4 increases mitochondrial metabolism up to 50% after 48 hours of treatment. On the contrary, treatment with APOE E2 reduces the mitochondrial activity 40–50 %. These effects were not observed in SH-SY5Y, probably because they lack the receptor. In order to confirm if these phenomena is explained by cell death or cell division, we measurement of free Lactate-Dehydrogenase (LDH) in the culture medium. There were no significant differences among different treatments with various APOE isoforms or with the control, which excludes these two processes as the explanation for the differences observed in the MTT assay. Another objective was to determine the effect of the different isoforms of APOE in a neurotoxic context. For this, the CAD cells were exposed to the isoforms of APOE and then treated with C2-ceramide, a lipid widely known for causing apoptosis in both cell lines. Pre-treatment with isoform APOE E2 seems to be protective against C2-ceramide, while neither E3 nor E4 variants showed any protection. We did not observe any protection or additional death in SH-SY5Y with any APOE isoform. Finally, we performed a measurement of the activation of the PI3K/Akt pathway using the phosphorylation of Akt protein in the Ser 473 residue as an activation marker upon exposure to different isoforms of APOE. Results showed over-activation of this pathway when cells were treated with APOE E4, while activation of Akt is reduced when treatment with APOE E2; results that are correlated with the observations of the MTT assays. In conclusion, APOE isoforms had a differential effect on the mitochondria metabolism in a short term, an effect that is correlated to activation of the PI3K/Akt pathway. The understanding of the physiology of the isoforms of APOE could be used with therapeutic goals for the treatment of neurodegenerative diseases.