Efecto de agonistas PPARs E IGF1 en modelos In Vitro de Leucodistrofias

Abstract

RESUMEN: Los oligodendrocitos son células gliales altamente especializadas del sistema nervioso central (SNC) encargadas de la formación de la mielina, la cual envuelve los axones de las neuronas y contribuye a la eficiencia y rapidez de la transmisión saltatoria de los potenciales de acción. La pérdida de la mielina resulta en la disminución de la velocidad del impulso nervioso con dispersión temporal, inhabilidad para sostener los trenes de los impulsos nerviosos y bloqueo de la conducción, lo cual puede relacionarse con varios desórdenes neurológicos, como las leucodistrofias, por ejemplo, la adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X (ALD-X) y la enfermedad de Krabbe (EK). Aunque, se ha avanzado en el entendimiento de la fisiopatología de este tipo de desórdenes, en la actualidad muchos aspectos son poco entendidos y faltan por conocer varios procesos relacionados con la biología básica de los oligodendrocitos, que de ser dilucidados contribuirían de manera positiva a la búsqueda de posibles blancos terapéuticos. Con base en lo anterior, en este trabajo se establecieron modelos in vitro para la ALD-X y la EK, con el propósito de estudiar el posible efecto de agonistas de receptores activados por el proliferador peroxisomal (PPARs, del inglés, peroxisome proliferator-activated receptors) y el factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF1, del inglés insulin-like growth factor 1) sobre las vías de señalización relacionadas con proliferación, supervivencia, metabolismo y diferenciación celular. Los PPARs son receptores nucleares conformados por al menos tres tipos: PPARα, PPARβ y PPARγ. Los PPARs regulan la expresión génica a través del reconocimiento y unión a los denominados elementos reguladores de respuesta a PPAR (PPREs, del inglés PPARs response elements) presentes en la región promotora de los genes blanco, los cuales se encargan de regular la expresión de genes implicados en el metabolismo de lípidos, aumentar la sensibilidad a la insulina, y mitigar la inflamación en patologías neurológicas y algunos tipos de cáncer, entre otros. Mientras tanto, el IGF1 tiene efecto en la transducción de vías de señalización dependientes de receptores tirosina cinasa, tales como las vías PI3K/AKT, MAPK/ERK1-2 y AMPK/mTOR. ADRENOLEUCODISTROFIA LIGADA AL CROMOSOMA X: La ALD-X se caracteriza por la acumulación de ácidos grasos de cadena muy larga (VLCFA, del inglés very large chain fatty acids), como consecuencia de mutaciones en el gen ABCD1 que conducen a la deficiencia de la proteína de la adrenoleucodistrofia (ALDP o Abcd1), encargada del transporte de los VLCFA hacia el interior de los peroxisomas para su β-oxidación. En este estudio se logró trabajar con los modelos in vitro de ALD-X por RNA de interferencia del gen ABCD1 en las líneas oligodendrogliales MO3.13 y B12, y con oligodendrocitos diferenciados obtenidos a partir de células madre pluripotentes inducibles (iPSCs, del inglés, induced Pluripotent Stem Cells) derivadas de pacientes con ALD-X infantil (cALD, del inglés, childhood adrenoleukodystrophy) y adrenomieloneuropatía (AMN). El análisis por western demostró que las células shABCD1 y los oligodendrocitos derivados de pacientes presentaban menor expresión de la proteína ALDP, lo cual se relacionó con mayor susceptibilidad a la muerte durante el proceso de diferenciación in vitro, disminución de la expresión de marcadores de maduración oligodendroglial, como la proteína básica de mielina (MBP) y CNPase. Adicionalmente, se encontró que las células deficientes de ALDP presentaron mayores niveles en la fosforilación de AKT (Ser 473) y disminución en la fosforilación de AMPKα/β (Thr 172 / Ser 108). Y solo el tratamiento con IGF1 por 24 horas y 4 días fue capaz de proteger de la muerte a las células MO3.13 shABCD1 durante el periodo de diferenciación. Adicionalmente, en los oligodendrocitos diferenciados obtenidos de iPSCs de pacientes con ALD-X se encontró pérdida del potencial de membrana mitocondrial y disminución de la intensidad de fluorescencia de los marcadores peroxisomales PMP70 y PEX14, así como disminución en la acetilación de la histona 3 y de residuos de lisinas. Finalmente, se concluyó que las vías PI3K/AKT y AMPK/mTOR están alteradas en los modelos de oligodendrocitos ALD-X analizados en este estudio, y que la alteración de estas vías podría ser el reflejo de la disfunción peroxisomal y mitocondrial que ocurre en los oligodendrocitos deficientes de ALDP, por tanto se sugiere que la activación de las vías PI3K/AKT y AMPK/mTOR podría actuar como un mecanismo neuroprotector para compensar la disfunción metabólica que ocurre en las células precursoras de oligodendrocitos (OPCs) y en los oligodendrocitos en el contexto neurotóxico de acumulación de ácidos grasos de cadena muy larga. ENFERMEDAD DE KRABBE: La EK es un desorden neurodegenerativo fatal, causado por mutaciones en el gen GALC, el cual codifica para la enzima lisosomal galactocerebrosidasa, GalC, estas mutaciones conducen a la disfunción de la enzima y a la acumulación de galactosilesfingosina (Psicosina), esfingolípido altamente nerotóxico, que genera muerte de oligodendrocitos y neuronas. En este trabajo se estudiaron los mecanismos moleculares involucrados en la muerte de oligodendrocitos por acumulación de Psicosina y el efecto neuroprotector del IGF1 y agonistas PPARs (Rosiglitazona, GW0742 y WY14643). En las células MO3.13, se desarrollaron dos modelos distintos de EK, uno exógeno por adición de Psicosina (10µM por 24 horas) y otro endógeno mediante el silenciamiento del gen GALC, usando un vector inducible con tetraciclina. Adicionalmente, los resultados obtenidos en las células MO3.13 se validaron en cultivos primarios de oligodendrocitos derivados de cerebros de ratones un día postnatal. Los resultados de esta investigación demuestran que la Psicosina impacta la vía de supervivencia PI3K/AKT por disminución de los niveles de fosforilación del receptor IGF1β (Tyr 1161) y AKT (Ser 473) y sugieren que la muerte celular producida por Psicosina puede ser atenuada por los pretratamientos de IGF1 y Rosiglitazona (agonista PPAR-γ). Asimismo, las células shGALC inducidas con tetraciclina no responden al tratamiento de IGF1 por una hora. Por otra parte, los tratamientos con IGF1 y Rosiglitazona aumentaron el número de peroxisomas y mitocondrias por célula, pero estos pretratamientos no lograron proteger a las células de la disminución del número de mitocondrias como efecto de la Psicosina. En conclusión, el tratamiento con Psicosina exógena o el silenciamiento del gen GALC para inducir acumulación de Psicosina endógena causó muerte celular, pérdida del número de mitocondrias por célula e inhibición de la vía PI3K/AKT y los pretratamientos con IGF1 y Rosiglitazona tienen un efecto neuroprotector en oligodendrocitos en el contexto de EK.

Abstract: Introduction: Oligodendrocytes are highly specialized cells that form myelin sheath around nerve fibers in the central nervous system (CNS). Myelin loss causes dysmyelinative disorders or leukodystrophies, such X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) caused by mutations in the ABCD1 gene that encodes the peroxisomal membrane protein ALDP which is involved in the transmembrane transport of very long-chain fatty acids (VLCFA); and Krabbe disease (KD) caused by mutations in the GALC gene that encodes the lysosomal enzyme β-galactocerebrosidase (Galc). Aim: To evaluate the effect of peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) agonists and insulin-like growth factor type 1 (IGF1) over PI3K/AKT, MAPK/ERK and AMPK/mTOR cell signaling pathways, oligodendroglial differentiation and mitochondrial and peroxisomal function in X-ALD and KD in vitro models. Methods: X-ALD and KD cell models in MO3.13 and B12 cell lines were made by RNA interference of ABCD1 and GALC genes, respectively. Furthermore, we used mouse oligodendrocytes primary cell cultures and induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from X-ALD patients. Results: We proved on X-ALD and KD cell models that oligodendrocytes show 1) more susceptible to cell death during oligodendroglial differentiation, 2) decreasing of mature oligodendrocyte markers (CNPase, Galc, MBP), 3) alterations in cellular signaling pathways, and 4) mitochondrial and peroxisomes dysfunction. Conclusion: Pretreatments with PPAR agonists (Rosiglitazone, GW0742, WY14643) and IGF1 have potential neuroprotective effect against oligodendrocytes cell death induced by accumulation of VLCFAs (X-ALD) and accumulation of Psychosine (KD).