Determinación in vitro del efecto de algunas sustancias liquénicas seleccionadas sobre el receptor de andrógenos, la enzima 5alfa-reductasa y la aromatasa para valorarlos como posibles prototipos de fármacos para el tratamiento de desórdenes dependientes de andrógenos

Abstract

Con la finalidad de contribuir al descubrimiento de fármacos para el tratamiento de desórdenes dependientes de andrógenos endógenos como la hiperplasia prostática benigna (HPB) y el cáncer de próstata (CaP), que a su vez constituyen problemas de salud pública en el entorno nacional y mundial, en el presente estudio determinó mediante métodos in vitro, la afinidad de algunas sustancias de origen liquénico para unirse al receptor de andrógenos (RA) e inhibir a las enzimas 5alfa-reductasa isoforma 2 (5α-R2) y la aromatasa (P450-arom), blancos de acción involucrados en dichas enfermedades. Las sustancias evaluadas previamente habían presentado afinidad ya sea por el RA o la 5α-R2 in silico.

Los compuestos objeto de estudio se aislaron y purificaron por métodos fitoquímicos convencionales a partir de extractos o fracciones enriquecidas provenientes de líquenes colombianos. Su identidad fue corroborada mediante comparación de su perfil cromatográfico con un patrón auténtico, o en caso de duda, mediante la determinación y análisis de sus datos de resonancia magnética nuclear (1H y 13C) comparando con los datos reportados en la literatura. Los compuestos a ensayar fueron: ácido úsnico (1), ácido descarboxithamnólico (2), esferoforina (3), atranorina (4), ácido bonínico (5), ácido 3-metoxicarbonil-2-hidroxi-6-metoxi-4-metilbenzoico (6), lobarielina (7), orselinato de metilo (8), ácido orselínico (9) y ácido atrárico (10). La afinidad de 1 a 10 para unirse al RA se determinó cuantificando el desplazamiento del ligando radiactivo mibolerona MIB[3H] unido al receptor de origen murino, por efecto de concentraciones crecientes de los compuestos de prueba, comparando dicho efecto con el causado por el mismo ligando no radiactivo (MIB) empleado como control. Solamente los compuestos 2 y 10 a baja concentración presentaron ligera afinidad por el RA (20 %) vs la presentada por el control (35 %).

Por su parte, para determinar la actividad inhibidora de la 5α-R2 se cuantificó la cantidad de dihidrotestosterona tritiada (DHT[1,2,6,7-3H) producida a partir de la reducción de testosterona tritiada (T[1,2,6,7-3H]) por la fracción enzimática de próstata humana, en presencia de diferentes concentraciones (10-11 a 10-3 M) de finasterida (F) o de los compuestos de prueba, calculando la concentración que produce el 50 % de la inhibición de la enzima (CI50). La esferoforina (3) y el ácido atrárico (10) inhibieron significativamente a la enzima, siendo más potente 10 (CI50 = 17.27 ± 0.1234 nM) que 3 (CI50 = 50.28 ± 0.5849 nM) y ambos, ligeramente menos potentes que F (CI50 = 8.5 ± 0.2 nM). Este hallazgo concuerda con la afinidad predicha in silico para estos compuestos.

La actividad inhibidora de la P450-arom se determinó cuantificando la cantidad de estradiol radiactivo (E2[6,7-3H]) producido a partir de la aromatización de testosterona tritiada (T[1,2,6,7-3H]) por la fracción citosólica de hígado de rata (representativa de la enzima) en presencia de diferentes concentraciones (10-11 a 10-3 M) de los compuestos de prueba o anastrozol, empleado como control. La atranorina (4) y el ácido atrárico (10) inhibieron significativamente a la enzima aromatasa de origen murino siendo 4 (CI50 = 49.31 ± 0.0694 nM) más potente que 10 (CI50 = 65.20 ± 0.1810 nM) y ambos, ligeramente menos potentes que el anastrozol (22.46 ± 0.58 nM).

Los compuestos esferoforina (3), atranorina (4) y ácido atrárico (10) se constituyen en candidatos para evaluarlos in vivo y considerarlos como posibles fármacos para el tratamiento de desórdenes dependientes de un exceso de andrógenos o de estrógenos entre ellos, el CaP, la HPB y el cáncer de mama. Los hallazgos de este estudio constituyen un aporte al estado del arte de las propiedades biológicas de las sustancias de origen liquénico.

With the purpose of contributing to the discovery of drugs for the treatment of endogenous androgen-dependent disorders such as benign prostatic hyperplasia (BPH) and prostate cancer (PCa), which in turn are public health problems in the national and global environment, in this study we determined by in vitro methods, the affinity of some lichen substances to bind the androgen receptor (RA) and inhibit the enzymes 5alpha-reductase isoform 2 (5α-R2) and aromatase (P450-arom) , which are targets involved in these diseases. The evaluated substances showed in silico affinity for either RA or 5α-R2.

The studied compounds were isolated and purified by conventional phytochemical methods from natural extracts or enriched fractions of Colombian lichens. Their identity was corroborated by comparing their chromatographic profile with an authentic pattern and in case of doubt, by determining and analyzing their nuclear magnetic resonance data (1H and 13C) compared with the those reported in the literature. The compounds to be tested were: usnic acid (1), decarboxythamnolic acid (2), sphaerophorin (3), atranorin (4), boninic acid (5), 3-methoxycarbonyl-2-hydroxy-6-methoxy-4-methylbenzoic acid (6), lobarielin (7), methyl orselinate (8), orselinic acid (9) and atraric acid (10).

The affinity of 1 to 10 to bind to the RA was determined by quantifying the displacement of radioactive ligand mibolerone MIB[3H] bound to the receptor (of murine origin), by effect of increasing concentrations of the test compounds and comparing this effect with that caused by non-radioactive ligand (MIB). Only 2 and 10 at low concentration had a slight affinity for RA (20%) vs that presented by the control (35%).

On the other hand, to determine the inhibitory activity of 5α-R2, the amount of tritiated dihydrotestosterone (DHT [1,2,6,7-3H) produced from the reduction of tritiated testosterone (T [1,2,6,7-3H]) by the enzymatic fraction of human prostate in the presence of different concentrations (10-11 to 10-3 M) of finasteride (F) or the test compounds, was quantified calculating the concentration that produces 50 % of the inhibition of the enzyme (IC50). Sphaerophorin (3) and atraric acid (10) significantly inhibited the enzyme being 10 (IC50 = 17.27 ± 0.1234 nM) more potent than 3 (IC50 = 50.28 ± 0.5849 nM) and both, less potent than F (IC50 = 8.5 ± 0.2 nM). This finding is consistent with the affinity predicted in silico for these compounds.

The inhibitory activity of P450-arom was determined by quantifying the amount of radioactive estradiol (E2 [6.7-3H]) produced from aromatization of tritiated testosterone (T [1,2,6,7-3H]) by the rat liver cytosolic fraction (representative of the enzyme) in the presence of different concentrations (10-11 to 10-3 M) of compounds or anastrozole (used as a control). Atranorin (4) and atraric acid (10) significantly inhibited aromatase being 4 (IC50 = 49.31 ± 0.0694 nM) more potent than 10 (IC50 = 65.20 ± 0.1810 nM) and both, less potent than anastrozole (22.46 ± 0.58 nM).

Sphaerophorin (3), atranorin (4) and atraric acid (10) are candidates for their evaluation in vivo in order to consider them as possible drugs for the treatment of disorders dependent on an excess of androgens or estrogens, including PCa, BPH and breast cancer.

The findings of this study constitute a contribution to the state of the art of the biological properties of substances of lichen origin.