Edición genética de la variedad de caña UFCP 82-1655 para inactivar el GEN BU1 y modificar la función del gen ALS mediante CRISPR/CAS9

Abstract

Genome editing is a technique used to accurately and efficiently modify the DNA within a cell. Since 2012, the CRISPR/Cas system has been used for gene editing (adding, interrupting or changing specific gene sequences) and for gene regulation in several species. For this investigation, this methodology was used to cause the functional elimination of the BU1 gene responsible for the leaf angle in sugarcane and to introduce a modification of the ALS gene to confer resistance to herbicides. To test the sugarcane gene editing system, two vectors were designed one for the BU1 gene and one for the ALS + BU1 genes, which were bombardment with a genetic gun in embryogenic calli of the UFCP 82-1655 sugarcane variety. After the bombardment, the tissue was selected with geneticin (20mg/L), the plants that survived were subjected to molecular tests using PCR, TaqMan assay and restriction enzymes. After selection with geneticin, 89 plants containing the plasmid with BU1 and 98 plants for the plasmid ALS + BU1 survived, after the molecular evaluation of these plants, the modification or insertion of the ALS gene in two plants (events ALS107 and ALS111) was found, these plants presented nucleotide T at position 653, while none of the plants turned out to be edited for the BU1 gene.

La edición del genoma es una técnica utilizada para modificar con precisión y eficiencia el ADN dentro de una célula. Desde 2012, el sistema CRISPR/Cas se ha utilizado para la edición de genes (agregando, interrumpiendo o cambiando las secuencias de genes específicos) y para la regulación génica en varias especies. Para esta investigación se utilizó esta metodología para provocar la eliminación funcional del gen BU1 responsable del ángulo de la hoja en caña de azúcar y para introducir una modificación del gen ALS para conferir resistencia a herbicidas. Para probar el sistema de edición de genes en caña de azúcar se diseñaron dos vectores, uno para el gen BU1 y otro para el gen ALS + gen BU1, los cuales fueron disparados por medio de una pistola genética en callos embriogénicos de la variedad de caña UFCP 82-1655. Después del bombardeo, el tejido se puso en selección con geneticina (20mg/L), a las plantas que sobrevivieron se les hicieron pruebas moleculares con PCR, ensayo TaqMan y enzimas de restricción. Después de la selección con geneticina sobrevivieron 89 plantas para el plásmido con BU1 y 98 plantas para el plásmido ALS + BU1, después de la evaluación molecular de estas plantas, se encontró la modificación o inserción del gen ALS en dos plantas (eventos ALS107 y ALS111), las cuales presentaron el nucleótido T en la posición 653, mientras que ninguna de las pantas resultó ser editada para el gen BU1.