Efecto del protocolo de vitrificación y sistemas de empaque sobre la tasa de supervivencia de embriones ovinos obtenidos in vivo

Abstract

La presente investigación tuvo como fin evaluar metodologías que faciliaran el proceso de vitrificación de embriones ovinos y la eliminación de potenciales contaminantes, comparando dos sistemas de empaque (abierto y cerrado) ya que el uso de empaques abiertos se consideran un riesgo de bioseguridad en este tipo de biotecnología reproductiva. Para este fin, se seleccionaron 25 ovejas trihibridas adultas en buenas condiciones sanitarias y nutricionales, cruces de razas Katahdin, Pelibuey y Dorset entre el primero y sexto parto. Se sincronizaron un grupo de cinco ovejas, cada 7 días durante cinco semanas mediante esponjas vaginales impregnadas con 60mg de Acetato Medroxiprogesterona por 13 días; además, se realizó un tratamiento de superovulación entre el día 11 al 14 de tratamiento con 160mg de Hormona Folículo Estimulante porcina (pFSH) en ocho dosis decrecientes, cada 12h paralelamente con la remoción del dispositivo vaginal en el día 13. Por otro lado, se realizó detección de celo con un macho vasectomizado y monta natural controlada, al día siete de esta se realizó recolección de embriones por medio de laparotomía. Subsiguientemente se evaluaron y clasificaron los embriones de acuerdo con las pautas de la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones, y se procedió a realizar criopreservación de sólo embriones categorizados como buenos y excelentes. Se obtuvieron 222 embriones de los cuales se criopreservaron 220, tomando un primer grupo (n=110, 50%) que se vitrificó mediante empaque Abierto (open-pulled Straw, OPS) y el segundo tratamiento experimental (n=110, 50%) se vitrificó a través del método cerrado con pajillas de 0.25cc. Ambos tratamientos divididos equitativamente por etapa de desarrollo y tipo de empaque. Se desvitrificaron 160 embriones, de los 220 congelados, ochenta por cada método de vitrificación los cuales fueron cultivados en una incubadora con 5% de CO2 en aire a 39° C por 72 horas, determinando el porcentaje de embriones reexpandidos a 24, 48 y 72 horas post desvitrificación y su tasa de eclosión, obteniendo una viabilidad del 72,6% (n= 80) para los embriones vitrificados por OPS y del 67,6% (n=80) para los embriones vitrificados por pajilla. Posteriormente se compararon las tasas de supervivencia embrionaria con la prueba de chi-cuadrado con un p-valor 0,49, concluyendo que no existe dependencia o asociación entre la variable (supervivencia) y el factor (empaque); las diferencias significativas se tomaron con un p<0,05. Finalmente, con este estudio se logró aplicar con éxito biotecnologías reproductivas como la ultrasonografía, laparoscopia, sincronización, superovulación, transferencia de embriones y criopreservación de embriones por medio de la vitrificación con dos sistemas de empaque en ovejas trihibridas bajo nuestras condiciones ambientales y de manejo. Considerando que el empaque cerrado es mejor en términos de bioseguridad y que no hubo diferencias con el sistema OPS, se recomienda trabajar el sistema cerrado para vitrificar embriones ovinos.

The purpose of this research was to evaluate two different packaging systems to cryopreserve ovine embryos avoiding potential contaminants in vitrification processes related to the use of open packages such as the open-pulled straw system, which is considered to be unsuitable for use in commercial embryo cryopreservation. For this purpose, 25 adult trihybrid ewes (crosses of Katahdin, Pelibuey and Dorset) in good sanitary and nutritional conditions were selected between the first and sixth lambing. Groups of five ewes were synchronized every 7 days for five weeks with intravaginal pessaries impregnated with 60mg of Medroxyprogesterone Acetate for 13 days. In addition, a superovulation treatment was performed between the 11th and 14th day of treatment with 160mg of porcine Follicle-Stimulating Hormone (pFSH) in eight decreasing doses every 12h. Controlled natural breeding was performed after estrus detection with a vasectomized male; seven days after natural breeding, embryo collection was performed by means of laparotomy. Subsequently, the embryos were evaluated and classified according to the guidelines of the International Embryo Transfer Society and only embryos categorized as excellent and good were used in cryopreservation treatments. From the 222 embryos obtained, 220 were cryopreserved; embryos were divided in two treatment groups: first group (n=110, 50%) which were vitrified in open-pulled straws (OPS) and the second group (n=110, 50%) were vitrified in 0.25cc straws. Both treatments were equally divided by developmental stage and type of packaging. For survival evaluation, 160 of the 220 embryos were devitrified, eighty by each method of packaging. These were immediately cultured in an incubator with 5% CO2 in air at 39° C for 72 hours, determining a percentage of embryos re-expanded at 24, 48 and 72 hours post-devitrification and the hatching rate. A viability of 72.6% (n=80) for the embryos vitrified by OPS and 67.6% (n=80) for the embryos vitrified by straw were obtained. Embryo survival rates were not significantly different among the two packaging methods (chi-square test) with a pvalue of 0.49. Finally, with this study, reproductive biotechnologies such as ultrasonography, laparoscopy, synchronization, superovulation, embryo transfer, and cryopreservation of embryos through vitrification with two packing systems were successfully applied in trihybrid ewes. Considering that a closed packaging system is safer in terms of biosecurity and that there were no significant differences in survival rates compared to the OPS system, we recommend to freeze sheep embryos with closed techniques such as the use of 0.25 cc straws.