Optimización de un cultivo celular tridimensional para evaluar la respuesta inducida por Aggregatibacter actinomycetemcomitans en células endoteliales

Abstract

En este trabajo se optimizó cultivo celular tridimensional (3D) de Células Endoteliales de Arteria Coronaria Humana (HCAEC) sobre soportes de colágeno tipo I para el estudio de la respuesta celular inducida por la presencia de Aggregatibacter actinomycetemcomitans, como modelo in vitro de enfermedad aterosclerótica. Se realizaron pruebas de caracterización fisicoquímica y la estandarización de un procedimiento que permitiera obtener soportes de colágeno tipo I sobre la cara apical completamente adheridos a las paredes internas de Insertos TranswellTM; luego sobre estos, se sembraron 5x105 HCAEC/inserto (cultivo 3D-HCAEC) con el fin de determinar la formación de monocapa y posteriormente, se infectó con A. actinomycetemcomitans a MOI 1:1, 1:10 y 1:100; se utilizaron como controles cultivos sin infección, así como con estimulación con LPS-Aa (1µg/mL), finalmente, se realizó un co-cultivo con monocitos THP-1, con el fin de evaluar procesos inflamatorios -migración y adhesión- al cultivo 3D-HCAEC; se realizaron ensayos por citometría de flujo con el fin de detectar las citocinas proinflamatorias, y la expresión de TGF-β1 mediante ELISA. La serie de experimentos se realizó por triplicado y la significancia para cada grupo fue tomada con p<0.05. Los resultados obtenidos permitieron determinar un cultivo 3D-HCAEC por 7 días, en donde se observó viabilidad y formación de monocapa continua sobre el soporte de colágeno elaborado, además se demostró la función de barrera endotelial. Los cultivos 3D-HCAEC infectados con A. actinomycetemcomitans a los diferentes MOI utilizados indujeron diferencias significativas con respecto al control en la adhesión y migración de monocitos THP-1. De igual manera, se mostró aumentos significativos respecto a los controles en la expresión los factores proinflamatorios: MCP-1, IL-8, IL-6 y TGF-β1. Estos resultados in vitro indican el potencial de A. actinomycetemcomitans en inducir una respuesta inflamatoria pro-aterosclerótica mediante un mecanismo de adhesión, migración de monocitos y disfunción endotelial. (Texto tomado de la fuente).

The role of periodontopathogens in inflammatory endothelial dysfunction is not known. This study characterizes a three-dimensional model with human coronary artery endothelial cells on three-dimensional (HCAEC-3D) type I collagen scaffolds to evaluate whether infection with Aggregatibacter actinomycetemcomitans induces a proinflammatory response associated with atherosclerosis. The HCAEC-3D culture was physicochemically characterized with regard to biocompatibility and barrier function. Then, the culture was infected with A. actinomycetemcomitans strain ATCC 29522 at multiplicities of infection (MOIs) of 1:1, 1:10, and 1:100. Cultures without infection and stimulated with A. actinomycetemcomitans lipopolysaccharide were used as controls. The secretion of soluble factors (IL-6, IL-1β, MCP-1, RANTES, MIP-1, IL-8, IL-1α, and TNF-α) was evaluated via flow cytometry; TGF-β1 was evaluated via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The adhesion and migration of fluorescent human THP-1 monocytes was evaluated. IL-8, MCP-1, and IL-6 secretion increased in a dose-dependent manner with A. actinomycetemcomitans infection and was significantly greater than that under control treatment. The concentration of TGF-β1 was significantly higher at MOI 1:100 than in controls. Treatment of the 3D cultures with A. actinomycetemcomitans at different MOIs induced significant differences in the adhesion of monocytes to the endothelium compared to the control without infection. Lastly, conditioned media from 3D cultures treated with A. actinomycetemcomitans induced monocyte migration. The effects of IL-8, MCP-1, IL-6, and TGF-β1 on the endothelium indicate the ability of A. actinomycetemcomitans to induce an inflammatory response through a mechanism of monocyte adhesion and migration and endothelial dysfunction.