Estudio Celular y Molecular del Gen POLR3A asociado al Síndrome Progeroide Neonatal (Síndrome de Wiedemann-Rautenstrauch)
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Tipo de contenido
Trabajo de grado - Maestría
Idioma del documento
EspañolFecha de publicación
2023-06-26Resumen
El síndrome de Wiedemann-Rautenstracuh (WRS) ha sido caracterizado como una entidad progeroide neonatal o de envejecimiento prematuro. Este grupo de síndromes tienen en común cambios monogenéticos que contribuyen a la aparición de fenotipos de envejecimiento que se evidencian en distintas etapas del desarrollo del individuo e in vitro presentan senescencia celular prematura. El WRS presenta un patrón de herencia autosómica recesiva cuya etiología es poco conocida. Recientemente se han descrito mutaciones en el gen POLR3A que codifica la subunidad catalítica A de la RNA polimerasa III. Esta enzima sintetiza un grupo de RNAs pequeños no codificantes (snRNAs), entre ellos tRNAs, 5S rRNA y U6 snRNA, que son importantes para el correcto funcionamiento del nucleolo, el ensamblaje de ribosomas, la traducción de proteínas y el metabolismo celular. Se planteó como objetivo describir las características celulares y moleculares de los fibroblastos WRS y la relación con un modelo de pérdida de función. Métodos: Se cultivaron fibroblastos primarios de dos pacientes WRS con variantes monoalélicas: WRS1[POLR3A c.3772_3773delCT (p. Leu1258Glyfs*12)] y WRS2 [POLR3A c.3G>T (p. Met1Leu*)]; fibroblastos knockout (KO) [POLR3A -/-] y fibroblastos control [POLR3A +/+]. Se determinó la expresión global de RNA mediante RNAseq, identificando los genes diferencialmente expresados de cada conjunto de datos, los cuales fueron filtrados y analizados según los criterios de exclusión a nivel estadístico y biológico. Se llevó a cabo un análisis de enriquecimiento funcional con las bases de datos Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Por RTqPCR, inmunofluorescencia y western blot, se analizaron los patrones de expresión de POLR3A, la expresión y localización de marcadores nucleolares y los niveles de marcadores de senescencia celular. Resultados: Se observó que hay un desbalance en la transcripción de los genes diana de la RNA Polimerasa III. Se encontraron perfiles de expresión diferenciales y se identificaron los genes diferencialmente expresados (DEGs) de cada conjunto de datos, siendo 204 en común entre el fenotipo WRS y 147 con la condición KO. El análisis de enriquecimiento funcional mostró sobrerrepresentadas múltiples categorías, entre ellas la vía PI3K-Akt, la interacción del receptor con la matriz extracelular, el metabolismo del retinol y la regulación de la respuesta inflamatoria. Se detectó una mayor área de inmunoreactividad de los componentes nucleolares en los fibroblastos WRS, mientras que el grupo KO muestra una reducción; a nivel transcripcional y traduccional, hay un desbalance de los distintos componentes estructurales, acompañado de la reducción de la síntesis de los precursores ribosomales. Por último, se encontró una regulación al alza de los marcadores de senescencia celular P53/P21, P16/RB y GLB1. Conclusión: Las células WRS experimentan un proceso de senescencia celular prematura asociado a las mutaciones de POLR3A que conducen a una alteración de su función transcripcional. Esto resulta en un aumento en el área nucleolar, un desequilibrio en la producción de los componentes nucleolares y una alteración en la biogénesis ribosomal. Además, el análisis de enriquecimiento funcional reveló que múltiples vías de señalización están comprometidas como la supervivencia celular, la interacción y organización de la matriz extracelular y regulación de la respuesta inflamatoria. Estos hallazgos contribuyen a mejorar nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes del WRS, que explican la alteración funcional de POLR3A y que dan lugar al fenotipo de envejecimiento prematuro y senescencia celular. También, amplían nuestra comprensión del panorama funcional del complejo RNA Polimerasa III en diversos componentes celulares, procesos biológicos y funciones moleculares. (Texto tomado de la fuente)Abstract
Wiedemann-Rautenstracuh Syndrome (WRS) has been characterized as a neonatal progeroid entity or premature aging disorder. This group of syndromes share monogenetic changes that contribute to the emergence of aging phenotypes manifested at different stages of individual development and display premature cellular senescence in vitro. WRS follows an autosomal recessive inheritance pattern, and its etiology is poorly understood. Recently, mutations in the POLR3A gene, which encodes the catalytic subunit A of RNA polymerase III, have been described. This enzyme synthesizes a group of small non-coding RNAs (snRNAs), including tRNAs, 5S rRNA, and U6 snRNA, which are crucial for proper nucleolar function, ribosome assembly, protein translation, and cellular metabolism. The objective of this study was to describe the cellular and molecular characteristics of WRS fibroblasts and their relationship with a loss-of-function model. Methods: Primary fibroblasts were cultured from two WRS patients with monoallelic variants: WRS1 [POLR3A c.3772_3773delCT (p. Leu1258Glyfs12)] and WRS2 [POLR3A c.3G>T (p. Met1Leu)], as well as knockout (KO) fibroblasts [POLR3A -/-] and control fibroblasts [POLR3A +/+] were included. Global RNA expression was determined using RNAseq, identifying the differentially expressed genes in each dataset, which were filtered and analyzed based on statistical and biological exclusion criteria. Functional enrichment analysis was performed using the Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) databases. Expression patterns of POLR3A, nucleolar marker expression and localization, and cellular senescence markers were analyzed using RT-qPCR, immunofluorescence, and western blotting. Results: It was observed that there is an imbalance in the transcription of target genes of RNA Polymerase III. Differential expression profiles were found, and the differentially expressed genes (DEGs) were identified in each dataset, with 204 genes in common between the WRS phenotype and 147 genes compared to the KO condition. Functional enrichment analysis showed multiple overrepresented categories, including the PI3K-Akt pathway, receptor interaction with the extracellular matrix, retinol metabolism, and regulation of the inflammatory response. A greater area of immunoreactivity in nucleolar components was detected in WRS fibroblasts, while the KO group showed a reduction. At the transcriptional and translational level, there was an imbalance in different structural components, accompanied by a decrease in the synthesis of ribosomal precursors. Finally, an upregulation of cellular senescence markers P53/P21, P16/RB, and GLB1 was found. Conclusion: WRS cells undergo a process of premature cellular senescence associated with POLR3A mutations, which lead to an alteration in their transcriptional function. This results in an increase in nucleolar area, an imbalance in the production of nucleolar components, and a disruption in ribosomal biogenesis. Furthermore, the functional enrichment analysis revealed that multiple signaling pathways are compromised, including cell survival, interaction and organization of the extracellular matrix, and regulation of the inflammatory response. These findings contribute to improving our understanding of the underlying mechanisms of WRS, explaining the functional impairment of POLR3A, and resulting in the phenotype of premature aging and cellular senescence. They also broaden our understanding of the functional landscape of the RNA Polymerase III complex in various cellular components, biological processes, and molecular functions.Palabras clave
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